一种重组质粒pZQ12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-PHA的重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种重组质粒pZQ12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl‑PHA的重组菌及其应用，属于基因工程技术领域。所述重组质粒pZQ12包括cimA基因插入到质粒pACYCDuet‑1的NcoI和BamHI多克隆位点处；leuBCD基因插入到质粒pACYCDuet‑1的BamHI和SacI多克隆位点处；ilvA基因插入到质粒pACYCDuet‑1的SacI和AscI多克隆位点；thrA*BC基因插入到质粒pACYCDuet‑1的AscI多克隆位点处。将重组质粒pZQ12和重组质粒pQQ05转入大肠杆菌LZ09中得到重组菌，以廉价且来源广的葡萄糖为唯一碳源并能合成奇偶数碳链单体共聚的mcl‑PHA。

A Recombinant Strain pZQ12 Synthesizing Even-odd Carbon Chain Monomer Copolymer mcl-PHA and Its Application

The invention provides a recombinant bacterium for synthesizing even and odd carbon chain monomer copolymerization MCL PHA and its application, which belongs to the field of genetic engineering technology. The recombinant plasmid pZQ12 includes the insertion of cimA gene into the NcoI and BamHI polyclonal sites of the plasmid pACYCDuet 1; the insertion of leuBCD gene into the BamHI and SACI polyclonal sites of the plasmid pACYCDuet 1; the insertion of ilvA gene into the SacI and ASCI polyclonal sites of the plasmid pACYCDuet 1; and the insertion of thrA*BC gene into the polyclonal sites of the plasmid pACYCDuet 1. The recombinant plasmid pZQ12 and pQQ05 were transformed into Escherichia coli LZ09 to obtain recombinant bacteria, which could synthesize MCL PHA with cheap and widely-sourced glucose as the sole carbon source and even-odd carbon chain monomer copolymerization.

【技术实现步骤摘要】
一种重组质粒pZQ12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-PHA的重组菌及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种重组质粒pZQ12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-PHA的重组菌及其应用。
技术介绍
随着石油化石燃料的不断消耗以及石化塑料造成的环境污染日益严重，生物基材料的开发与合成备受关注。聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，简称PHA)，作为碳源和能源的贮藏材料，是一类由微生物合成的生物聚酯。PHA因具有生物可降解性、生物兼容性等优良性能，被越来越多地用作环境友好型材料，以替代传统的石油基塑料。PHA的组成单体3-羟基脂肪酸(3-hydroxyalkanoate，简称3HA)种类繁多、性质各异。正因为PHA单体结构的多样性，使得其产生材料的性能亦具有多样性(即从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体)，因而比其他生物可降解材料具有更广阔的应用前景。一般来说，中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl-PHA)，含有6～14个碳原子。传统的mcl-PHA单体结构和组成难以调控、生产成本较高、工业生产得率较低，而且已有的mcl-PHA种类单一、应用范围有限，因此，适用于生物材料、精细化工、医药营养等领域的新型mcl-PHA亟待开发合成。另外，只含有偶数碳链单体的mcl-PHA已经显示出理想的物理和机械性能，如果在其中增加奇数碳链单体的组分能够赋予该种生物材料更高的强度和柔韧性，使其更具有新颖性和实用性。但目前合成的含奇数碳链单体的mcl-PHA单体只有3HHp、3HN等，碳链长度短、单体种类单一且合成所用的碳源价格昂贵、对微生物细胞具有毒性，不利于细胞生长和mcl-PHA的合成与积累。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种重组质粒pZQ12、合成奇偶数碳链单体共聚mcl-PHA的重组菌，能够在仅利用葡萄糖为碳源的条件下进行发酵，合成奇偶数碳链单体共聚的mcl-PHA。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种重组质粒pZQ12，cimA基因插入到质粒pACYCDuet-1的NcoI和BamHI多克隆位点处；leuBCD基因插入到质粒pACYCDuet-1的BamHI和SacI多克隆位点处；ilvA基因插入到质粒pACYCDuet-1的SacI和AscI多克隆位点；thrA*BC基因插入到质粒pACYCDuet-1的AscI多克隆位点处；所述cimA基因具有序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；所述leuBCD基因具有序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述ilvA基因具有序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；所述thrA*BC基因具有序列表中SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种上述方案所述重组质粒pZQ12的制备方法，包括如下步骤：1)采用NcoI和BamHI分别对质粒pACYCDuet-1和cimA基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1和cimA基因；2)将所述步骤1)的酶切后的pACYCDuet-1和cimA基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA；3)采用BamHI和SacI分别对所述步骤2)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因；4)将所述步骤3)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD；5)采用SacI和AscI分别对所述步骤4)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因；6)将所述步骤5)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA；7)采用AscI分别对所述步骤6)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因进行单酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因；8)将所述步骤7)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因连接，得到重组质粒pZQ12。优选的，所述步骤1)中cimA基因的制备方法包括如下步骤：a.提取甲烷细菌MB1的总DNA；b.以所述步骤a的总DNA为模板，采用引物cimA-F和cimA-R扩增cimA基因，得到cimA基因；所述引物cimA-F具有序列表中SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；所述引物cimA-R具有序列表中SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。优选的，所述步骤3)中leuBCD基因的制备方法包括如下步骤：(1)提取大肠杆菌MG1655的总DNA；(2)以所述步骤(1)的总DNA为模板，采用引物leuBCD-F和leuBCD-R扩增leuBCD基因，得到leuBCD基因；所述引物leuBCD-F具有序列表中SEQIDNo.7所示的核苷酸序列；所述引物leuBCD-R具有序列表中SEQIDNo.8所示的核苷酸序列。优选的，所述步骤5)中ilvA基因的制备方法包括如下步骤：①提取荧光假单胞菌PICF7的总DNA；②以所述步骤①的总DNA为模板，采用引物ilvA-F和ilvA-R扩增ilvA基因，得到ilvA基因；所述引物ilvA-F具有序列表中SEQIDNo.9所示的核苷酸序列；所述引物ilvA-R具有序列表中SEQIDNo.10所示的核苷酸序列。优选的，所述步骤b、(2)和②中扩增的扩增程序独立为：预变性：94℃，5min，1个循环；变性：94℃，45s，退火：55～60℃，45s，延伸：72℃，2min，其中变性、退火、延伸都各经历30个循环；终延伸：72℃，10min。优选的，所述步骤7)中thrA*BC基因的制备方法包括如下步骤：(S1)提取大肠杆菌MDS42的总DNA；(S2)以所述步骤S1的总DNA为模板，采用引物thrA-F1/thrA-R1和thrA-F2/thrA-R2分别进行扩增，得到两条片段；(S3)将所述步骤S2得到的两条片段混合后，将得到的混合片段为模板，采用引物thrA-F1和thrA-R2进行扩增，得到定点突变后的thrA*基因；(S4)以所述步骤S1的总DNA为模板，采用引物thrBC-F/thrBC-R进行扩增，得到thrBC基因；(S5)以所述步骤S3的thrA*基因和所述步骤S4的thrBC基因为模板，采用引物thrA*BC-F/thrA*BC-R进行扩增，得到thrA*BC基因；所述引物thrA-F1具有序列表中SEQIDNo.11所示的核苷酸序列；所述引物thrA-R1具有序列表中SEQIDNo.12所示的核苷酸序列；所述引物thrA-F2具有序列表中SEQIDNo.13所示的核苷酸序列；所述引物thrA-R2具有序列表中SEQIDNo.14所示的核苷酸序列；所述引物thrBC-F具有序列表中SEQIDNo.15所示的核苷酸序列；所述引物thrBC-R具有序列表中SEQIDNo.16所示的核苷酸序列；所述引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒pZQ12，其特征在于，cimA基因插入到质粒pACYCDuet‑1的NcoI和BamHI多克隆位点处；leuBCD基因插入到质粒pACYCDuet‑1的BamHI和SacI多克隆位点处；ilvA基因插入到质粒pACYCDuet‑1的SacI和AscI多克隆位点；thrA*BC基因插入到质粒pACYCDuet‑1的AscI多克隆位点处；所述cimA基因具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述leuBCD基因具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述ilvA基因具有序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述thrA*BC基因具有序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pZQ12，其特征在于，cimA基因插入到质粒pACYCDuet-1的NcoI和BamHI多克隆位点处；leuBCD基因插入到质粒pACYCDuet-1的BamHI和SacI多克隆位点处；ilvA基因插入到质粒pACYCDuet-1的SacI和AscI多克隆位点；thrA*BC基因插入到质粒pACYCDuet-1的AscI多克隆位点处；所述cimA基因具有序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；所述leuBCD基因具有序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述ilvA基因具有序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；所述thrA*BC基因具有序列表中SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述重组质粒pZQ12的制备方法，包括如下步骤：1)采用NcoI和BamHI分别对质粒pACYCDuet-1和cimA基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1和cimA基因；2)将所述步骤1)的酶切后的pACYCDuet-1和cimA基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA；3)采用BamHI和SacI分别对所述步骤2)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因；4)将所述步骤3)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA和leuBCD基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD；5)采用SacI和AscI分别对所述步骤4)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因进行双酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因；6)将所述步骤5)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD和ilvA基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA；7)采用AscI分别对所述步骤6)的重组质粒pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因进行单酶切，得到酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因；8)将所述步骤7)的酶切后的pACYCDuet-1-cimA-leuBCD-ilvA和thrA*BC基因连接，得到重组质粒pZQ12。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中cimA基因的制备方法包括如下步骤：a.提取甲烷细菌MB1的总DNA；b.以所述步骤a的总DNA为模板，采用引物cimA-F和cimA-R扩增cimA基因，得到cimA基因；所述引物cimA-F具有序列表中SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；所述引物cimA-R具有序列表中SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中leuBCD基因的制备方法包括如下步骤：(1)提取大肠杆菌MG1655的总DNA；(2)以所述步骤(1)的总DNA为模...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄倩倩，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37