杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素及其制备和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素及其制备和应用。所述嵌合酶抗生素包括胞质转导肽CTP与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDlys串联的重组蛋白CTP‑JDlys。所述嵌合酶抗生素的制备方法包括：S1、设计引物，分别以裂解酶JDlys基因和胞质转导肽CTP基因为模板，扩增JDlys基因片段和CTP基因片段；S2、将扩增得到的JDlys基因构建重组质粒，将扩增得到的CTP基因插入至所述重组质粒中JDlys基因的5`端，构建含目标基因片段CTP‑JDlys的重组质粒；S3、将所述含目标基因片段CTP‑JDlys的重组质粒经表达、纯化后，获得嵌合酶抗生素蛋白CTP‑JDlys。本发明专利技术提供的CTP‑JDlys蛋白能进入皮肤角质细胞内高效治疗耐药金黄色葡萄球菌引起的小鼠皮肤脓肿。

Chimeric Enzyme Antibiotics to Kill Staphylococcus aureus and Their Preparation and Application

The invention provides a chimeric enzyme antibiotic for killing Staphylococcus aureus and its preparation and application. The chimeric antibiotic comprises a recombinant protein CTP_JDlys, which is in series with the cytoplasmic transduction peptide CTP and the bacteriophage lyase JDlys of Staphylococcus aureus. The preparation methods of chimeric antibiotics include: S1, design of primers, amplification of JDlys gene fragment and CTP gene fragment using lysozyme JDlys gene and cytoplasmic transduction peptide CTP gene as templates respectively; S2, construction of recombinant plasmid by amplifying JDlys gene, insertion of the amplified CTP gene into the 5 `end of JDlys gene in the recombinant plasmid, and construction of CTP_JDlys gene fragment containing the target gene. After expressing and purifying the recombinant plasmid containing the target gene fragment CTP_JDlys, the chimeric antibiotic protein CTP_JDlys was obtained. The CTP JDlys protein provided by the invention can enter the skin keratinocytes and efficiently treat the skin abscess of mice caused by drug-resistant Staphylococcus aureus.

【技术实现步骤摘要】
杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素及其制备和应用
本专利技术属于生物
，是一种生物
的新型酶抗生素的制备及其治疗表皮角质细胞内细菌感染的应用，具体涉及一类能够高效进入真核细胞内部杀灭耐药金黄色葡萄球菌的新型嵌合酶抗生素的生物合成及胞内和皮肤脓肿杀菌效果的评估；更具体地，涉及一种杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素及其制备和应用。
技术介绍
皮肤及皮肤组织感染(skinandskinstructureinfections,SSSIs)是由各类化脓性致病菌侵犯表皮、真皮和皮下组织引起的炎症性疾病。引起SSSIs的病原体有很多，主要包括金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌及绿脓假单胞菌等。其中，金黄色葡萄球菌是引起SSSIs最常见的病原菌。皮肤角质细胞是皮肤表皮中最主要的细胞，积极参与和协调皮肤的先天免疫反应。最近的研究表明，在金黄色葡萄球菌感染的早期，角质细胞能够发挥类似免疫细胞的功能，识别并传递病原信号，并且能够产生抗菌肽和促炎性细胞因子抵抗金黄色葡萄球菌的感染。研究表明金黄色葡萄球菌能够入侵角质细胞并在其内持续存活，从而逃避上述一系列的免疫反应，导致皮肤的持续感染。然而，大多数抗菌药物对金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染束手无策。例如，抗生素很难自由的进入真核细胞，无法有效的杀灭细胞内的细菌；而小分子抗菌肽抗菌谱较广，从而导致皮肤中微生态平衡的破坏。此外，近年来，由于抗生素的过度使用，临床分离的金黄色葡萄球菌出现了严重的耐药情况(例如耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)的分离)，这对金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染的治疗提出了更严峻的挑战，因此寻求一类高效不耐药的抵抗胞内感染的新型抗菌制剂显得尤为重要。噬菌体是一类可以感染并裂解细菌的病毒，其强大的裂菌功效主要得益于感染后期合成的细胞壁水解酶，该酶可通过特异性水解细胞壁氨基糖之间的糖苷键，达到快速裂解细菌的目的，因此也称为酶抗生素或裂解酶(Lysin)。与抗生素相比，酶抗生素活性强，作用迅速，且不易诱导细菌产生耐药性，也不会对人和动物产生不良影响，是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种选择性方法。作为一类大分子蛋白酶，该类酶抗生素无法自由进入真核细胞内部，因此对细菌引起的胞内感染并无良好的治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有抗菌制剂对胞内细菌感染治疗的不足，提供一种能够进入真核细胞内部的酶抗生素的技术方法。胞质转导肽(Cytoplasmictransductionpeptide，CTPs)介导的细胞内递送是有效介导外源蛋白进入真核细胞的新型策略。CTPs是一类富含阳离子的短肽，可以成功运送功能蛋白进入细胞内部。CTPs种类繁多，而大部分CTPs的作用机制并没有被详细阐明。同时，CTPs对细胞的损伤程度及毒性也因细胞种类不同而差异较大。此外，CTPs与目的蛋白的串联表达也存在不少技术难点，例如CTPs与目的蛋白串联位置及串联方式，有可能影响串联蛋白的空间结构以及生物学活性。因此，从多种CTPs中选择一个适合本专利技术的胞质转导肽，并且筛选到CTPs与串联蛋白的最优连接方式是本专利技术的技术难点。本专利技术将三种CTP蛋白(Tat型CTP：来源于HIV病毒的11个氨基酸残基；Ant型CTP：来源于果蝇的触角足肽段残基；TP10型CTP：来源于黄蜂毒液相关的神经肽甘丙肽残基。)分别串联至酶抗生素蛋白的N端和C端，通过酶活性实验、胞内杀菌实验及细胞毒性实验综合评估了三种CTP串联蛋白的胞内外杀菌效果，最终发现其中Tat型CTP(CTPTat)具有低的细胞毒性，与酶抗生素串联后不会影响其杀菌活性，同时具有优于传统抗生素的胞内杀菌效果，获得了一种高效进入真核细胞内部杀灭耐药金黄色葡萄球菌的新型嵌合酶抗生素。本专利技术将酶抗生素编码的基因与CTP基因串联表达。在CTP的帮助下，酶抗生素进入表皮角质细胞内高效的杀死胞内的耐药金黄色葡萄球菌。此外通过建立小鼠表皮脓肿感染-治疗模型，评估CTP介导裂解酶在动物体内的杀菌效果。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术提供一种杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素，所述嵌合酶抗生素包括胞质转导肽CTP与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDlys串联的重组蛋白CTP-JDlys。优选地，所述胞质转导肽CTP为Tat型CTP、Ant型CTP或TP10型CTP；所述重组蛋白CTP-JDlys为重组蛋白CTPTat-JDlys、CTPAnt-JDlys或CTPTP10-JDlys。优选地，所述胞质转导肽CTP为Tat型CTP；所述重组蛋白CTP-JDlys为重组蛋白CTPTat-JDlys。第二方面，本专利技术提供一种所述杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素的制备方法，包括如下步骤：S1、设计引物，分别以金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDlys基因和胞质转导肽CTP基因为模板，扩增JDlys基因片段和CTP基因片段；S2、将扩增得到的JDlys基因构建重组质粒，将扩增得到的CTP基因插入至所述重组质粒中JDlys基因的5`端，构建含目标基因片段CTP-JDlys的重组质粒；S3、将步骤S2所得的含目标基因片段CTP-JDlys的重组质粒经表达、纯化后，获得胞质转导肽CTP与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDlys串联的的嵌合酶抗生素蛋白CTP-JDlys。优选地，步骤S1中，所述金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDLys基因和胞质转导肽CTPs基因分别参考GenBank中金黄色葡萄球菌噬菌体的基因组序列和胞质转导肽的基因序列合成。优选地，步骤S1中，所述裂解酶JDlys基因的上游引物JDlys-F的序列如SEQIDNO.1所示，所述裂解酶JDlys基因的下游引物JDlys-R的序列如SEQIDNO.2所示。优选地，步骤S1中，所述转膜肽CTP基因为转膜肽CTPTP10基因、转膜肽CTPAnt基因或转膜肽CTPTP10基因。更优选地，所述转膜肽CTPTat基因的上游引物CTPTat-F的序列如SEQIDNO.3所示，所述转膜肽CTPTat基因的下游引物CTPTat-R的序列如SEQIDNO.4所示；所述转膜肽CTPAnt基因的上游引物CTPAnt-F的序列如SEQIDNO.5所示，所述转膜肽CTPAnt基因的下游引物CTPAnt-R的序列如SEQIDNO.6所示；所述转膜肽CTPTP10基因的上游引物CTPTP10-F的序列如SEQIDNO.7所示，所述转膜肽CTPTP10基因的下游引物CTPTP10-R的序列如SEQIDNO.8所示。优选地，步骤S2中，构建含目标基因片段CTP-JDlys的重组质粒的具体步骤为：以金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDLys基因为模板，构建JDLys-pET-28a重组表达载体；将扩增得到的CTP基因(CTPTat，CTPANT，CTPTP10)插入至JDLys-pET-28a重组表达载体中JDLys基因的5`端。优选地，步骤S3中，所述表达、纯化的步骤包括：将含目标基因片段CTP-JDlys的重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆进行蛋白的诱导表达和鉴定，纯化后获得重组蛋白CTP-JDlys。第三方面，本专利技术提供一种所述嵌合酶抗生素在金黄色葡萄球菌感染角质细胞模型和金黄色葡萄球菌感染小鼠表皮脓肿模型中的应用。优选地，所述金黄色葡萄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素，其特征在于，所述嵌合酶抗生素包括胞质转导肽CTP与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDlys串联的重组蛋白CTP‑JDlys。

【技术特征摘要】
1.一种杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素，其特征在于，所述嵌合酶抗生素包括胞质转导肽CTP与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDlys串联的重组蛋白CTP-JDlys。2.根据权利要求1所述的杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素，其特征在于，所述胞质转导肽CTP为Tat型CTP、Ant型CTP或TP10型CTP；所述重组蛋白CTP-JDlys为重组蛋白CTPTat-JDlys、CTPAnt-JDlys或CTPTP10-JDlys。3.根据权利要求1或2所述的杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素，其特征在于，所述胞质转导肽CTP为Tat型CTP；所述重组蛋白CTP-JDlys为重组蛋白CTPTat-JDlys。4.一种根据权利要求1所述的杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、设计引物，分别以金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDlys基因和胞质转导肽CTP基因为模板，扩增JDlys基因片段和CTP基因片段；S2、将扩增得到的JDlys基因构建重组质粒，将扩增得到的CTP基因插入至所述重组质粒中JDlys基因的5`端，构建含目标基因片段CTP-JDlys的重组质粒；S3、将步骤S2所得的含目标基因片段CTP-JDlys的重组质粒经表达、纯化后，获得胞质转导肽CTP与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶JDlys串联的的嵌合酶抗生素蛋白CTP-JDlys。5.根据权利要求4所述的杀灭金黄色葡萄球菌的嵌合酶抗生素的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述裂解酶JDlys基因的上游引物JDlys-F的序列如SEQIDNO.1所示，所述裂解酶JDlys基因的下游引物JD...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建和，王兆飞，严亚贤，孔里程，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31