一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒，可灵敏、快速、准确检测隐孢子虫的PCR。本发明专利技术提供的试剂盒能够运用于隐孢子虫病原的大规模检测，也可用于隐孢子虫病的分子流行病学调查及药物疫苗效果监测。本发明专利技术是建立在分子生物学基础上的一种特异性强、灵敏度高的快速检测方法，大大提高了检测效率和准确率，提高了隐孢子虫病原的检出率，降低了假阴性率。

A Rapid PCR Kit for Detecting Cryptosporidiasis Based on Rhomboid Gene and Its Application

The present invention provides a rapid detection kit for Cryptosporidium by PCR based on rhomboid gene, which can detect Cryptosporidium sensitively, rapidly and accurately. The kit provided by the invention can be used for large-scale detection of Cryptosporidium pathogens, molecular epidemiological investigation of Cryptosporidium and monitoring of drug vaccine effect. The invention is a fast detection method with strong specificity and high sensitivity based on molecular biology, which greatly improves the detection efficiency and accuracy, improves the detection rate of Cryptosporidium pathogen, and reduces the false negative rate.

【技术实现步骤摘要】
一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒及应用
本专利技术涉及生物技术，尤其涉及一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒，能够快速检测各种粪便中的隐孢子虫卵囊，以达到快速检测隐孢子虫的目的。
技术介绍
隐孢子虫病是由隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)寄生于人或动物胃肠道和禽类呼吸道上皮细胞内引起的一种全球性的人兽共患寄生虫病。该病可感染人和多种动物，在自然界中广泛存在，对免疫功能低下的个体危害尤为严重，常导致其持续性腹泻或营养不良，甚至危及生命。在牲畜中，这种疾病可能带来严重的经济损失，尤其对于犊牛、羔羊和鸡而言，感染后死亡率高，会导致动物生长迟缓。随着全世界腹泻疾病报告数量的增加，2015年全球因腹泻死亡人数约为130万人，隐孢子虫病成为5岁以下儿童死亡的第四大病因。隐孢子虫能感染包括人类在内的240多种动物，临床上以腹泻为主要特征。本病的传播主要以粪一口途径为主。在病人、畜禽的粪便中含有大量的卵囊，含有卵囊的粪便通过污染环境、饮水、食物等，经口进入机体而使健康人和畜禽遭受感染。隐孢子虫病流行非常广泛，不受季节和地域的限制。不同地区隐孢子虫的感染率不同，存在地区性差异。关于该病的诊断，20世纪80年代以前主要是对肠粘膜进行活检，后发展到对粪便中的卵囊直接染色镜检，但是病原学检测方法费时、费力、检出率低，易出现假阴性。此外，隐孢子虫卵囊的直径很小，只有4～6微米，很容易与粪便样品中的其他物质混淆。虽然将常规的饱和蔗糖漂浮法(浓缩卵囊)与改良抗酸(MAF)染色联合使用，可将镜检的灵敏度提高至54.8％，但这些富集方法往往不足以检测到无明显症状感染的隐孢子虫病患者中卵囊的存在。此外，改良抗酸染色法通常需要专业技术人员操作，并且染色涂片上的其他类似物质会干扰结果的判断。因此，急需一种简单快捷、省时省力、适用于临床诊断的检测方法。PCR检测方法操作简单，灵敏度高、特异性强，且能达到快速诊断的目的，利于基层推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含：PCR试剂管、100bpDNAMarker、溴化乙锭染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品；其中PCR试剂管中包含LATaqDNA聚合酶、10×LATaqPCRBuffer、dNTP、ddH2O、检测用引物。所用检测用引物分别为隐孢子虫rhomboid基因上游引物和下游引物共2条：上游引物(简称CpF):5'-GGTCATTTTGGCTTCACACTGG-3'(SEQIDNo：1)下游引物(简称CpR):5'-AACAAATCCACCGATATGGGC-3'(SEQIDNo：2)。标准品序列为微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)具有SEQIDNo：3的核苷酸序列，具体序列见序列表。对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为含隐孢子虫DNA的DNA样本，阴性对照为无隐孢子虫DNA的DNA样本。以上试剂均保存于-20℃，尽量避免反复冻融，若需多次使用，可预先分装。本专利技术的另一个目的是提供所述试剂盒在检测隐孢子虫中的应用。通过以下步骤实现：每次应用均应设立阴性对照和阳性对照，标准品用ddH2O稀释为20.1ng/μl。(1)PCR反应管制备：总体积为20μl。PCR试剂管中包括LATaqDNA聚合酶0.2μl，10×LATaqPCRBuffer2μl，dNTP1.6μl，上下引物各0.6μl，ddH2O14μl，保存于-20℃。将PCR试剂管置于于冰上融化，往里加入浓度20.1ng/μl的样本DNA(待检测样本、标准品、阳性对照品、阴性对照品)1μl即为PCR反应管，充分混匀后瞬时高速离心5s。(2)扩增检测：PCR反应管置于PCR仪上，反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸25s共35个循环；72℃延伸5min，16℃保存。(3)检测结果判定：称取1g琼脂糖，加入100ml的0.5×TAE电泳缓冲液，混匀后幷加热充分溶解，然后加入3μl溴化乙锭DNA染料，倾倒适量于凝胶板中。待凝胶冷却凝固后，取8μlPCR产物与适量上样缓冲液混合，加入凝胶孔中进行电泳，凝胶成像仪下观察并拍照记录结果。标准品孔和阳性对照孔均有目的条带而阴性对照孔无任何条带说明PCR反应检测成功。被检样本孔出现电泳条带，且与标准品孔、阳性对照孔相应条带大小一致(约360bp左右)则判定为阳性，反之则为阴性。本专利技术的优点：本专利技术提供了一种能够快速检测隐孢子虫的PCR检测方法，其优点是灵敏、快速、准确，此方法能够运用于隐孢子虫病原的大规模检测，也可用于隐孢子虫病的分子流行病学调查及药物疫苗效果监测。本方法是建立在分子生物学基础上的一种特异性强、灵敏度高的快速检测方法，大大提高了检测效率和准确率，提高了隐孢子虫病原的检出率，降低了假阴性率。附图说明图1基于rhomboid基因的隐孢子虫标准品的PCR检测。图2基于rhomboid基因的隐孢子虫阳性样本的PCR检测结果。图3本专利技术试剂盒对部分样本检测结果。具体实施方式本专利技术将结合附图和具体实施例作进一步说明。应当理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。实施例一基于rhomboid基因的隐孢子虫标准品的PCR检测1.材料LATaqDNA聚合酶反应体系、pMD19-T克隆体系和100bpDNAladder等均购自宝生物工程(大连)有限公司，通用型基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，凝胶回收试剂盒和质粒小量抽提试剂盒购自杭州艾思进有限公司，氨苄青霉素、溴化乙锭等常用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR仪购自Eppendorf公司。2.引物设计与合成以Genbank上公布的微小隐孢子虫rhomboid基因序列为参考，使用PrimerPremier5.0软件设计引物，利用Primerblast分析其特异性，然后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3.检测标准品制备将纯化的微小隐孢子虫卵囊液装入冻存管内，放入液氮中冷冻5min，然后迅速转移至65℃的水浴锅内融化，如此反复冻融5次。将冻融后的卵囊液12000g离心5min，弃去上清，留沉淀按照通用基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA作为模板。制备含上述成对引物的PCR反应管，并在PCR仪上进行扩增，反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸25s共35个循环；72℃延伸5min，16℃保存。PCR产物通过1％琼脂糖核酸电泳检测，将条带大小正确的凝胶割下并利用凝胶回收试剂盒回收。回收产物经克隆体系插入pMD19-T载体，转化入Top10大肠杆菌，挑选阳性克隆送至杭州华大基因研发中心进行测序。将测序表明插入正确片段的相应质粒加ddH2O调整为20.1ng/μl，即为标准品。4.结果经测序分析，上述设计的标准品与预期相符，隐孢子虫标准品目的基因序列如序列表SEQIDNo：3。PCR结果见图1：M：100bpDNAladder；1：隐孢子虫标准品；2：阴性对照品。实施例二基于rhomboid基因的隐孢子虫阳性样本的PCR检测1.样本DNA提取分别采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：PCR试剂管、100bp DNA Marker、溴化乙锭染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品；其中PCR试剂管中包含LA Taq DNA聚合酶、10×LA Taq PCR Buffer、dNTP、ddH2O、检测用引物；检测用引物分别为隐孢子虫rhomboid基因上游引物和下游引物共2条上游引物CpF:5'‑GGTCATTTTGGCTTCACACTGG‑3'下游引物CpR:5'‑AACAAATCCACCGATATGGGC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：PCR试剂管、100bpDNAMarker、溴化乙锭染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品；其中PCR试剂管中包含LATaqDNA聚合酶、10×LATaqPCRBuffer、dNTP、ddH2O、检测用引物；检测用引物分别为隐孢子虫rhomboid基因上游引物和下游引物共2条上游引物CpF:5'-GGTCATTTTGGCTTCACACTGG-3'下游引物CpR:5'-AACAAATCCACCGATATGGGC-3'。2.根据权利要求1所述的一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，标准品为微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)，其核苷酸序列如SEQIDNo：3所示；对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为含隐孢子虫DNA的DNA样本，阴性对照为无隐孢子虫DNA的DNA样本。3.根据权利要求1所述的一种基于rhomboid基因的隐孢子虫病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，试剂均保存于-20℃，尽量避免反复冻融，若需多次使用，可预先分装。4.权利要求1所述的试剂盒在检测隐孢子虫中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨怡，杜爱芳，阳毅敏，陈学秋，周静茹，赵明，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33