一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体及其制备方法和应用，包括：1)PPF聚合物的制备，2)PPR聚合物制备，3)纳米基因载体的制备；4)将PPFR聚合物和基因加入到HEPES缓冲液中，再在水浴中温育形成稳定的纳米复合物。通过将某些肿瘤主动靶向受体分子或细胞荧光分子接枝到PP预聚物上合成得到聚合物。得到的聚合物具有很好的生物相容性，亲水性好，所使用热聚合反应和催化反应的合成方法环保、操作简单而且原料成本便宜。由于引入某些肿瘤主动靶向受体分子和细胞荧光分子提高聚合物对肿瘤的靶向能力和生物成像能力，为聚合物在生物成像以及肿瘤中的应用得到了很大的提高。

A nano-gene vector for in vivo targeted tumour imaging and therapy and its preparation and Application

The invention discloses a nano gene carrier for in vivo targeting tumour imaging and treatment, and its preparation method and application, including: 1) preparation of PPF polymer, 2) preparation of PPR polymer, 3) preparation of nano gene carrier, 4) addition of PPFR polymer and gene to HEPES buffer solution, and then incubation in water bath to form stable nanocomposite. Polymers were synthesized by grafting some tumor-targeting receptor molecules or cell fluorescent molecules onto PP prepolymers. The obtained polymers have good biocompatibility and hydrophilicity. The synthetic methods of thermal polymerization and catalytic reaction are environmentally friendly, simple and cheap. The introduction of some tumor active targeting receptor molecules and cell fluorescent molecules improves the targeting ability and bioimaging ability of polymers for tumors, which greatly improves the application of polymers in bioimaging and tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体及其制备方法和应用
本专利技术属于可降解生物医用材料
，具体涉及一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体及其制备方法和应用。
技术介绍
随着基因治疗研究的不断深入，开发具有目的基因靶向、可控并有效表达的载体是基因治疗成功的关键。但是在目前基因治疗过程中，广泛使用的非病毒载体却由于其自身免疫原性高且存在潜在的致癌性，导致其临床使用存在很多的安全问题，相比之下，非病毒基因载体由于其独特的优点受到人们越来越多的关注。此外，随着各种科学技术的快速发展，细胞内精细结构、细胞间的相互作用、细胞信号转导以及大分子蛋白的作用等可以通过荧光显微镜得到观测，但是细胞在可见光区的自发荧光对荧光材料所发信号的遮掩和荧光有机染料分子易发生光漂白的问题却阻碍了荧光成像技术和荧光探针的开发和研究，因此，开发具有光稳定性、多功能化以及易调控等优点的荧光纳米材料会得到很好的应用前景。聚合物是一种新型的荧光纳米材料，由于其具有优良的光学特性、稳定性好及修饰方便等优点，使其在生物成像，疾病治疗等邻域有着广阔的应用前景。目前，聚酯类生物材料是最具发展潜力的一类合成型生物可降解高分子材料，其具有可控的力学及降解性能和优异的生物相容性的特点。聚酯类生物材料可分为聚ε-己内酯(PCL)、聚丙交酯(PLA)等线性聚酯生物材料和聚癸二酸-甘油酯(PGS)、聚柠檬酸-1,8-辛二醇酯(POC)等网络型聚酯生物材料。其中POC由柠檬酸和1,8-辛二醇通过缩合反应形成的，其合成单体无毒、生物相容性良好、反应条件简单、反应过程中无杂质引入且价格便宜，此外，柠檬酸还是人体三羧酸代谢产物，且其上三个羧酸基团通过聚乙二醇(PEG)和聚乙烯亚胺(PEI)进行修饰后，所得到的聚柠檬酸-1,8-辛二醇酯-聚乙二醇-聚乙烯亚胺(PP)预聚物具有良好的生物相容性，但是其缺乏体内靶向肿瘤成像的能力，使其作为基因载体在机体内的应用受到了很大的局限，如果能够通过进一步修饰PP预聚物，使其自身荧光特性、对基因的转染能力以及对肿瘤的靶向能力得到提高，在机体中的应用将会得到很大的提高。
技术实现思路
针对目前基因治疗过程中使用具有高自身免疫原性和存在潜在致癌性的非病毒载体，以及传统的荧光分子较差的亲水性、光稳定性及在机体内稳定性等缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体及其制备方法和应用，该方法工艺简单，制得的材料具有良好的体内靶向肿瘤成像与治疗能力。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体的制备方法，包括以下步骤：1)PPF聚合物的制备：将PP预聚物和肿瘤主动靶向受体分子加入到MES缓冲液中，以EDC和NHS作为催化剂进行反应，得到PPF聚合物；2)PPR聚合物制备：将PP预聚物和细胞荧光分子加入到MES缓冲液中，以EDC和NHS作为催化剂进行反应，得到PPR聚合物；3)纳米基因载体的制备：将上述合成的PPF聚合物和PPR聚合物溶解在去离子水中，得到PPFR聚合物溶液；4)将PPFR聚合物和基因加入到HEPES缓冲液中，再在水浴中温育形成稳定的纳米复合物，得到用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体。作为本专利技术的进一步改进，步骤1)中的肿瘤主动靶向受体分子为叶酸；PP预聚物为聚柠檬酸酯预聚物。作为本专利技术的进一步改进，步骤1)中PP预聚物和肿瘤主动靶向受体分子的反应摩尔比为1:(0.2～1.0)；反应体系用NaOH溶液调节溶液pH值至8.0～9.0室温搅拌反应。作为本专利技术的进一步改进，步骤2)中的细胞荧光分子为罗丹明B。作为本专利技术的进一步改进，步骤2)中PP预聚物和细胞荧光分子的反应摩尔比为1:(0.2～1.0)；反应体系用NaOH溶液调节溶液pH值至8.0～9.0室温搅拌反应。作为本专利技术的进一步改进，步骤3)中PPF聚合物和PPR聚合物的质量比是1:(0.5～2)。作为本专利技术的进一步改进，步骤4)中的基因为DNA、siRNA或miRNA。作为本专利技术的进一步改进，步骤4)中PPFR聚合物和基因均是以(0.3～20):1的氮磷摩尔比溶解到HEPES缓冲液中；缓冲液为pH为7～8的HEPES缓冲液；纳米复合物是在36℃～38℃水浴中温育10～50分钟形成。一种由所述方法制得的用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体。所述的用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体在活细胞成像、体内靶向肿瘤成像及治疗中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术针对目前基因治疗过程中使用具有高自身免疫原性和存在潜在致癌性的非病毒载体，以及传统的荧光分子较差的亲水性、光稳定性及在机体内稳定性等缺点提供了一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体的制备方法，该方法将聚柠檬酸酯预聚物(PP)与某些肿瘤主动靶向受体分子或细胞荧光分子通过催化反应，得到PPF和PPR聚合物，最后通过PPF和PPR聚合物以不同质量比溶解在去离子水中，得到PPFR聚合物溶液。通过向PP中引入某些肿瘤主动靶向受体分子如叶酸可以显著提高聚合物对肿瘤的靶向能力，引入细胞荧光分子如罗丹明B可以显著提高聚合物的生物成像能力。本专利技术制备方法简单方便，所使用热聚合反应和催化反应的合成方法环保、操作简单而且原料成本便宜。通过实验结果证明：该方法制备的纳米基因载体PPFR聚合物具有很好的生物相容性、基因转染效率以及体内靶向肿瘤成像与治疗的能力。进一步，本专利技术所使用的聚柠檬酸酯预聚物(PP)是一种可降解脂肪族聚酯高分子，其生物相容性良好，亲水性好，制备方法简单且单体廉价易得。本专利技术通过两步化学反应制备的PP预聚物虽然具有很好的生物相容性、亲水性以及一定的荧光和基因转染能力，但是该聚合物缺乏体内靶向肿瘤成像的能力。因此，通过引入某些肿瘤主动靶向受体分子如叶酸可以显著提高聚合物对肿瘤的靶向能力，引入细胞荧光分子如罗丹明B可以显著提高聚合物的生物成像能力。进一步，本专利技术利用叶酸对聚柠檬酸酯预聚物(PP)进行改性，改善了聚柠檬酸酯预聚物的肿瘤靶向能力，使其具有体内靶向肿瘤治疗能力，在基因治疗中的应用将会得到很大的提高。进一步，本专利技术利用罗丹明B对聚柠檬酸酯预聚物(PP)进行改性，改善了聚柠檬酸酯预聚物的荧光特性，使其具有长波长荧光发射能力，在生物成像中的应用将会得到很大的提高。本专利技术中制备的纳米基因载体具有良好的基因转染、肿瘤靶向及荧光能力，因此用于体内靶向肿瘤成像与治疗。附图说明图1是本专利技术合成的用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体中各种单体以及聚合物的结构式；其中A为叶酸的结构式，B为罗丹明B的结构式，C为聚柠檬酸酯预聚物(PP)的结构式，D为PPF聚合物的结构式，E为PPR聚合物的结构式。图2是本专利技术合成的用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体中各单体、PPF和PPR聚合物的FT-IR图谱。图3是本专利技术合成的用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体中PPR聚合物的光学特性；其中A为激发波长下表现出较强的荧光强度，B为荧光特性图。图4是本专利技术合成的用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体中聚合物的基因负载能力的测定。图5是本专利技术合成的用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体中聚合物的细胞毒性的测定，A和B是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)PPF聚合物的制备：将PP预聚物和肿瘤主动靶向受体分子加入到MES缓冲液中，以EDC和NHS作为催化剂进行反应，得到PPF聚合物；2)PPR聚合物制备：将PP预聚物和细胞荧光分子加入到MES缓冲液中，以EDC和NHS作为催化剂进行反应，得到PPR聚合物；3)纳米基因载体的制备：将上述合成的PPF聚合物和PPR聚合物溶解在去离子水中，得到PPFR聚合物溶液；4)将PPFR聚合物和基因加入到HEPES缓冲液中，再在水浴中温育形成稳定的纳米复合物，得到用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体。

【技术特征摘要】
1.一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)PPF聚合物的制备：将PP预聚物和肿瘤主动靶向受体分子加入到MES缓冲液中，以EDC和NHS作为催化剂进行反应，得到PPF聚合物；2)PPR聚合物制备：将PP预聚物和细胞荧光分子加入到MES缓冲液中，以EDC和NHS作为催化剂进行反应，得到PPR聚合物；3)纳米基因载体的制备：将上述合成的PPF聚合物和PPR聚合物溶解在去离子水中，得到PPFR聚合物溶液；4)将PPFR聚合物和基因加入到HEPES缓冲液中，再在水浴中温育形成稳定的纳米复合物，得到用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体。2.根据权利要求1所述的一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体的制备方法，其特征在于，步骤1)中的肿瘤主动靶向受体分子为叶酸；PP预聚物为聚柠檬酸酯预聚物。3.根据权利要求1所述的一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体的制备方法，其特征在于，步骤1)中PP预聚物和肿瘤主动靶向受体分子的反应摩尔比为1:(0.2～1.0)；反应体系用NaOH溶液调节溶液pH值至8.0～9.0室温搅拌反应。4.根据权利要求1所述的一种用于体内靶向肿瘤成像与治疗的纳米基因载体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷波，王敏，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61