一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法技术

本发明专利技术涉及一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，属于甘蔗组培研究技术领域。该方法以蔗株顶生幼叶为外植体，经启动培养和继代培养，获得胚性愈伤，并在光诱导条件下产生大量胚性细胞团。本发明专利技术提供的甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，主要包括外植体的选择、接种、启动培养、继代培养和光诱导，可一次性大量获得具有极强分化再生能力的胚性细胞团，有效解决了以往甘蔗热带种材料胚性细胞团获取困难的问题，可为相关科研和生产提供一种简易、高效、可靠的胚性细胞团来源。

A Method of Inducing Embryogenic Cell Cluster of Tropical Sugarcane Seeds

The invention relates to a method for inducing embryogenic cell mass of tropical sugarcane seed, belonging to the technical field of sugarcane tissue culture research. In this method, sugarcane terminal young leaves were used as explants, embryogenic callus was obtained by initiation culture and subculture, and a large number of embryogenic cell clusters were produced under light-induced conditions. The method for inducing embryogenic cell mass of tropical sugarcane seed provided by the invention mainly includes the selection of explants, inoculation, start-up culture, subculture and light induction. The embryogenic cell mass with strong differentiation and regeneration ability can be obtained in large quantities at one time, which effectively solves the difficulty of obtaining embryogenic cell mass of tropical sugarcane seed material in the past, and provides a simple way for relevant scientific research and production. Efficient and reliable source of embryogenic cell mass.

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法
本专利技术属于甘蔗组培研究
，具体涉及一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法。
技术介绍
甘蔗热带种（Saccharumofficinarum）是现代栽培品种（SaccharumHybrid）的原始亲本，具有较为原始和简单的基因组结构，科研上作为甘蔗遗传学研究的便利材料而具有重要科研价值；同时具有大茎、高糖分、低纤维的农艺特征，生产上作为果蔗品种而具有重要经济价值。胚性细胞团是植物离体培养中产生的、由大量胚性细胞组成的团块，具有极强的全能性和分化能力。在分子遗传学研究方面，胚性细胞团是最为理想的外源基因受体；在组培快繁等实际应用方面，胚性细胞团具有远超一般愈伤的增殖分化能力和遗传稳定性。建立一套轻简高效的热带种胚性细胞团诱导技术体系，不仅可为相关基础科研提供便利，还有利于提高果蔗组培繁种育苗效率，具有重要的现实价值。目前，我国对甘蔗胚性细胞团诱导研究还仅限于少数栽培品种。经研究人员努力，新台糖16号、22号，以及桂糖21号、28号等甘蔗栽培品种先后成功诱导获得胚性细胞团，建立了较为成熟的栽培品种胚性细胞团诱导技术体系。出乎意料的是，长期研究过程中发现，按照现有体系进行甘蔗热带种胚性细胞团诱导，几乎完全无法实现。这表明，热带种与现代甘蔗品种间已经具有了极其显著的遗传分化，对于诱导体系产生了截然不同的反应。因此，有必要开发一套专门适用于热带种的胚性细胞团诱导技术体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，该方法包括外植体取材、外植体接种与启动培养、继代培养诱导胚性愈伤、光诱导胚性细胞团产生等步骤，实现了甘蔗热带种胚性细胞团的高效诱导。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，包括如下步骤：步骤（1），外植体取材：选择8-10月龄甘蔗热带种健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精消毒后剥取最内层3片幼叶作为外植体；步骤（2），外植体接种与启动培养：将步骤（1）所得外植体切为单层叶块，叶背向上接种于启动培养基，28℃黑暗培养2-3周，得到愈伤组织；所述的启动培养基为MS+2,4-D3.0mg/L+复酞核酸1.0mg/L+蔗糖15.0g/L+琼脂粉5.0g/L，pH为5.8-5.9；步骤（3），继代培养诱导胚性愈伤：将步骤（2）得到的愈伤组织切成小块后，接种于继代培养基，28℃黑暗培养2-3周后可转化为胚性愈伤；所述的继代培养基为MS+2,4-D1.5mg/L+复酞核酸0.5mg/L+蔗糖45.0g/L+琼脂粉5.0g/L，pH为5.8-5.9；步骤（4），光诱导胚性细胞团产生：将步骤（3）所得胚性愈伤转移至光诱导培养基，28℃光照培养2-3周后胚性愈伤表面产生大量胚性细胞团；所述的光诱导培养基为MS+2,4-D1.0mg/L+复酞核酸1.0mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂粉5.0g/L，pH为5.8-5.9。进一步，优选的是，步骤（1）中，选取8-10月龄蔗株顶端生长点以上10cm区段内最内层3片幼叶作为外植体。进一步，优选的是，步骤（1）中，选取8-10月龄蔗株顶端生长点以上3-8cm区段内最内层3片幼叶作为外植体。进一步，优选的是，步骤（2）中，叶块宽为2-4mm，长为4-6mm。进一步，优选的是，步骤（3）中，愈伤组织切成2-5mm见方的小块。进一步，优选的是，步骤（4）中，光照培养条件为：使用红蓝色LED光源，波长分别为660nm、450nm，红蓝光比例为1:1-3:1，总光量子通量密度为300-800μmol/m2·s，日光照时长12-16h，黑暗时长8-12h。本领域公知，影响植物胚性细胞团形成的因素有很多，如外植体取材时期、接种方式、生长调节剂配比、培养条件等，其中，生长调节剂的配比是最为关键的影响因素。近年来，复酞核酸等新型植物生长调节剂的出现为本研究提供了新的选择。研究过程中更发现，蔗糖浓度这一前人忽视的因素，对甘蔗细胞分化进程调控具有重要影响；而诱导过程中的光照，是促进胚性细胞团形成的关键。综合以上发现，本研究建立了与以往不同的技术体系——诱导过程中使用复酞核酸这一新型植物生长调节剂，不同生长阶段使用不同蔗糖浓度，使用光照而非传统的黑暗诱导条件——最终成功建立了新的，特别适用于甘蔗热带种的胚性细胞团诱导技术体系。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：胚性细胞团是甘蔗科学研究和繁重育苗的理想材料。目前，我国甘蔗胚性细胞团诱导技术体系还仅限于包括上述品种在内的少数栽培品种，甘蔗热带种的诱导技术尚不成熟。虽然栽培品种先后成功建立了胚性细胞团诱导技术体系，但经长期研究发现，按照栽培品种取得的技术体系进行热带种胚性细胞团诱导，效率极其低下，完全无法满足应用需求。这表明，热带种与现代甘蔗品种间已经具有了极其显著的遗传分化，对于诱导体系产生了截然不同的反应。有鉴于此，本专利技术提供了一套专门适用于热带种的胚性细胞团诱导技术体系。本专利技术中，使用新型植物生长调节剂复酞核酸，在不同生长阶段使用不同的蔗糖浓度，并在胚性细胞团诱导阶段采用光培养而非常规的暗培养，最终建立了专门适用于甘蔗热带种的胚性细胞团诱导技术体系。本专利技术的技术方法可大量诱导获得热带种胚性细胞团，可为甘蔗科研和繁种提供稳定高效的胚性细胞团来源。附图说明图1为胚性细胞团产生于胚性愈伤表面的图片；图2为从胚性愈伤表面剥离的黑车里本基因型的胚性细胞团的图片；图3为从胚性愈伤表面剥离的越南牛蔗基因型的胚性细胞团的图片；图4为胚性细胞团在空白MS培养基增殖、分化的图片。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本专利技术所述甘蔗热带种，为植物分类学意义上的禾本科甘蔗属热带种植物，拉丁名为Saccharumofficinarum，包括但不限于拔地拉、越南牛蔗、路打士、黑车里本等基因型，为甘蔗遗传改良重要亲本，并可直接用作水果甘蔗。本专利技术所述的无菌镊子、无菌手术刀等为通常意义上的经高压湿热灭菌的镊子和手术刀，没有特殊限制。本专利技术所述胚性愈伤是指表面粗糙、干湿适中、淡黄色云耳状的愈伤组织，可在继代培养过程中由普通愈伤诱导获得。本专利技术所述胚性细胞团是指在光培养过程中，胚性愈伤表面诱导形成的紧致、干燥、颗粒状的细胞团，具有极强的再生和分化能力。本专利技术所述操作过程，应严格按照常规组培规程进行无菌操作，以避免污染。本专利技术对于接种密度无特殊要求，但不宜过密，直径9cm的培养皿接种量以不多于25块外植体或愈伤为宜。光诱导阶段应尽量选择高透光材料培养皿，并单层放置，如需多层放置，则应间隔摆放，以保证受光均匀。实施例1一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，包括如下步骤：步骤（1），外植体取材：选择8月龄甘蔗热带种健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精喷施消毒后入超净工作台，以无菌手术刀切取生长点以上5-10cm内区段，以无菌镊子层层剥除外层叶片，取其最内层3片幼叶，作为外植体；步骤（2）本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），外植体取材：选择8‑10月龄甘蔗热带种健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精消毒后剥取最内层3片幼叶作为外植体；步骤（2），外植体接种与启动培养：将步骤（1）所得外植体切为单层叶块，叶背向上接种于启动培养基，28℃黑暗培养2‑3周，得到愈伤组织；所述的启动培养基为MS+2,4‑D 3.0mg/L+复酞核酸 1.0mg/L+蔗糖 15.0g/L+琼脂粉 5.0g/L，pH为5.8‑5.9；步骤（3），继代培养诱导胚性愈伤：将步骤（2）得到的愈伤组织切成小块后，接种于继代培养基，28℃黑暗培养2‑3周后可转化为胚性愈伤；所述的继代培养基为MS+2,4‑D 1.5mg/L+复酞核酸 0.5mg/L+蔗糖45.0g/L+琼脂粉 5.0g/L，pH为5.8‑5.9；步骤（4），光诱导胚性细胞团产生：将步骤（3）所得胚性愈伤转移至光诱导培养基，28℃光照培养2‑3周后胚性愈伤表面产生大量胚性细胞团；所述的光诱导培养基为MS+2,4‑D 1.0mg/L+复酞核酸 1.0mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂粉 5.0g/L，pH为5.8‑5.9。...

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），外植体取材：选择8-10月龄甘蔗热带种健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精消毒后剥取最内层3片幼叶作为外植体；步骤（2），外植体接种与启动培养：将步骤（1）所得外植体切为单层叶块，叶背向上接种于启动培养基，28℃黑暗培养2-3周，得到愈伤组织；所述的启动培养基为MS+2,4-D3.0mg/L+复酞核酸1.0mg/L+蔗糖15.0g/L+琼脂粉5.0g/L，pH为5.8-5.9；步骤（3），继代培养诱导胚性愈伤：将步骤（2）得到的愈伤组织切成小块后，接种于继代培养基，28℃黑暗培养2-3周后可转化为胚性愈伤；所述的继代培养基为MS+2,4-D1.5mg/L+复酞核酸0.5mg/L+蔗糖45.0g/L+琼脂粉5.0g/L，pH为5.8-5.9；步骤（4），光诱导胚性细胞团产生：将步骤（3）所得胚性愈伤转移至光诱导培养基，28℃光照培养2-3周后胚性愈伤表面产生大量胚性细胞团；所述的光诱导培养基为MS+2,4-D1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李纯佳，李旭娟，字秋艳，刘新龙，刘洪博，林秀琴，徐超华，陆鑫，毛钧，
申请(专利权)人：云南省农业科学院甘蔗研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53