【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种农杆菌介导割手密遗传转化的方法。
技术介绍
1、甘蔗(saccharum spp.)是我国首要糖料作物，贡献了全国90％以上的食糖产量。甘蔗良种选育是我国蔗糖产业健康发展、食糖安全充分保障的关键和基础。现代甘蔗育种很大程度上依赖于野生种质的血缘渗透。割手密(saccharum spontaneum)是甘蔗近缘种植物中育种应用最为成功的野生种质资源。目前，几乎所有甘蔗栽培品种中均含有割手密血缘。割手密具有强分蘖、强抗逆、广适应、耐贫瘠等优良特性，因而成为现代甘蔗育种抗逆性和适应性的主要基因来源。割手密优异基因挖掘，成为甘蔗遗传改良的重要课题。
2、遗传转化是植物基因鉴定的前提和关键。目前，已有若干关于甘蔗遗传转化技术体系建立和优化的报道。然而，这些研究仅局限于甘蔗栽培品种，关于甘蔗野生资源的研究较为鲜见，割手密遗传转化技术体系的研究目前甚至未见报道。近年来，随着全基因组测序完成，割手密成为甘蔗属中首个具有参考基因组序列的物种，为甘蔗育种提供了大量候选基因。为从鉴定这些候选基因的功能和育种价值，亟需建立割手密遗传转化体系。
3、农杆菌介导法成本低、拷贝数低、重复性好，是甘蔗及其近缘属植物遗传转化的首选方法。本专利技术尝试在割手密中建立农杆菌介导的遗传转化技术体系。研究过程中发现，与roc22等常用甘蔗栽培品种不同，割手密遗传转化面临严重的褐化问题，并且这种褐化几乎贯穿实验的全部过程；特别是农杆菌浸染后的严重褐化，极易造成农杆菌污染，更成为决定遗传转化成功与否的关键
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种农杆菌介导割手密遗传转化的方法，以解决上述现有技术存在的问题。该方法克服了目前割手密遗传转化易褐化的问题，成功构建了农杆菌介导割手密愈伤组织遗传转化体系，实现了割手密遗传转化从0到1的突破。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种农杆菌介导割手密遗传转化的方法，包括以下步骤：
4、(1)以割手密顶端生长点为外植体，诱导培养获取胚性愈伤组织；
5、(2)将所述胚性愈伤组织在lacl3溶液中热激，之后超声处理，再转至农杆菌浸染液中浸染处理；浸染后的所述胚性愈伤组织转至共培养培养基中，进行暗培养，之后利用lacl3溶液、抗氧化剂溶液以及特美汀溶液进行清菌处理；
6、(3)清菌处理后的所述胚性愈伤组织转至恢复培养基，进行暗培养；
7、(4)经恢复培养后的所述胚性愈伤组织依次转至愈伤筛选培养基和分化筛选培养基，进行分化筛选，得到分化苗；
8、(5)将所述分化苗转至生根诱导培养基诱导生根，得到抗性苗；
9、(6)抗性苗以常规手段进行炼苗、假植、转基因鉴定(如除草剂喷施检测、分子检测等)，得到阳性转基因割手密植株。
10、优选的是，在步骤(1)中，所述外植体的获取方法为：取6-8月龄割手密植株的梢头，剥除外层老叶、叶鞘，灭菌后，于18-22℃黑暗静置14-36h，之后无菌获取割手密梢头顶端生长点以上2-7cm区段，逐层剥除外层老叶，留取最内层2-3片心叶，即为所述外植体。
11、优选的是，在步骤(1)中，诱导培养时，诱导培养基包括以下组分：1/2ms+2,4-d2.0mg/l+柠檬酸150mg/l+半胱氨酸100mg/l+pvp 500mgl+蔗糖30g/l+琼脂粉8.0g/l；培养条件为：28℃暗培养，每3周继代1次。
12、优选的是，在步骤(2)中，所述胚性愈伤组织在45℃的lacl3溶液中热激3-5min，所述lacl3溶液的浓度为10-20mm；
13、所述超声处理的条件为：40khz超声震荡1-3min。
14、优选的是，在步骤(2)中，所述浸染液包括以下组分：1/2ms+2,4-d 0.5mg/l+蔗糖10-20g/l+葡萄糖10-20g/l+乙酰丁香酮20-30mg/l；
15、所述浸染处理的条件为：室温28-44kpa真空处理5-15min后，黑暗静置15-20min；
16、优选的是，在步骤(2)中，所述共培养培养基包括以下组分：1/2ms+2,4-d 1.0mg/l+柠檬酸150mg/l+半胱氨酸100mg/l+蔗糖10-15g/l+葡萄糖15-20g/l+乙酰丁香酮20mg/l；共培养条件为：22℃黑暗培养3d。
17、优选的是，在步骤(2)中，共培养后的胚性愈伤组织先用无菌水清洗至澄清，之后依次于lacl3溶液、抗氧化剂溶液、特美汀溶液分别浸泡20min，其中，所述lacl3溶液浓度为10-13.5mm；抗氧化剂溶液为含柠檬酸150mg/l、半胱氨酸100mg/l、2-吗啉乙磺酸50mm的水溶液，ph值为5.8；所述特美汀溶液浓度为300mg/l。
18、优选的是，在步骤(3)中，所述恢复培养基包括以下组分：1/2ms+2,4-d 2.0mg/l+柠檬酸150mg/l+半胱氨酸100mg/l+pvp 500mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉8.0g/l+特美汀200mg/l；培养条件为：28℃黑暗培养2周。
19、优选的是，在步骤(4)中，所述愈伤筛选培养基包括以下组分：1/2ms+2,4-d2.0mg/l+柠檬酸150mg/l+半胱氨酸100mg/l+pvp 500mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉8.0g/l+特美汀200mg/l+ppt 1.0mg/l；培养条件为：28℃进行黑暗培养，每3周继代一次；
20、所述分化筛选培养基包括以下组分：1/2ms+6-ba1.0mg/l+柠檬酸150mg/l+半胱氨酸100mg/l+pvp 500mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉8.0g/l+特美汀200mg/l+ppt 1.0mg/l；培养条件为：温度为28℃，光照强度为60-70μmol/s/m2，光周期为光照12h/黑暗12h，每3周继代一次。
21、优选的是，在步骤(5)中，所述生根诱导培养基包括以下组分：1/2ms+naa2.0mg/l+活性炭1.5g/l+蔗糖30g/l+琼脂粉8.0g/l+特美汀200mg/l+ppt 0.5mg/l；培养条件为：温度为28℃，光照强度为60-70μmol/s/m2，光周期为光照12h/黑暗12h，每3周继代一次。
22、本专利技术公开了以下技术效果：
23、本专利技术在现有技术构建甘蔗遗传转化体系的基础上，通过优化技术方案，首次在割手密中成功建立了遗传转化技术体系，并且转化效率为2.7％以上，达到了农杆菌介导本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种农杆菌介导割手密遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述外植体的获取方法为：取6-8月龄割手密植株的梢头，剥除外层老叶、叶鞘，灭菌后，于18-22℃黑暗静置14-36h，之后无菌获取割手密梢头顶端生长点以上2-7cm区段，逐层剥除外层老叶，留取最内层2-3片心叶，即为所述外植体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，诱导培养时，诱导培养基包括以下组分：1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸150mg/L+半胱氨酸100mg/L+PVP 500mgL+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L；培养条件为：28℃暗培养，每3周继代1次。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述胚性愈伤组织在45℃的LaCl3溶液中热激3-5min，所述LaCl3溶液的浓度为10-20mM；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述浸染液包括以下组分：1/2MS+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖10-20g/L+葡萄糖10
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述共培养培养基包括以下组分：1/2MS+2,4-D 1.0mg/L+柠檬酸150mg/L+半胱氨酸100mg/L+蔗糖10-15g/L+葡萄糖15-20g/L+乙酰丁香酮20mg/L；共培养条件为：22℃黑暗培养3d。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，共培养后的胚性愈伤组织先用无菌水清洗至澄清，之后依次于LaCl3溶液、抗氧化剂溶液、特美汀溶液分别浸泡20min，其中，所述LaCl3溶液浓度为10-13.5mM；抗氧化剂溶液为含柠檬酸150mg/L、半胱氨酸100mg/L、2-吗啉乙磺酸50mM的水溶液，pH值为5.8；所述特美汀溶液浓度为300mg/L。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述恢复培养基包括以下组分：1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸150mg/L+半胱氨酸100mg/L+PVP 500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L+特美汀200mg/L；培养条件为：28℃黑暗培养2周。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述愈伤筛选培养基包括以下组分：1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+柠檬酸150mg/L+半胱氨酸100mg/L+PVP 500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L+特美汀200mg/L+PPT 1.0mg/L；培养条件为：28℃进行黑暗培养，每3周继代一次；
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述生根诱导培养基包括以下组分：1/2MS+NAA2.0mg/L+活性炭1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L+特美汀200mg/L+PPT0.5mg/L；培养条件为：温度为28℃，光照强度为60-70μmol/s/m2，光周期为光照12h/黑暗12h，每3周继代一次。
...【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导割手密遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述外植体的获取方法为：取6-8月龄割手密植株的梢头，剥除外层老叶、叶鞘，灭菌后，于18-22℃黑暗静置14-36h，之后无菌获取割手密梢头顶端生长点以上2-7cm区段，逐层剥除外层老叶，留取最内层2-3片心叶，即为所述外植体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，诱导培养时，诱导培养基包括以下组分：1/2ms+2,4-d 2.0mg/l+柠檬酸150mg/l+半胱氨酸100mg/l+pvp 500mgl+蔗糖30g/l+琼脂粉8.0g/l；培养条件为：28℃暗培养，每3周继代1次。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述胚性愈伤组织在45℃的lacl3溶液中热激3-5min，所述lacl3溶液的浓度为10-20mm；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述浸染液包括以下组分：1/2ms+2,4-d 0.5mg/l+蔗糖10-20g/l+葡萄糖10-20g/l+乙酰丁香酮20-30mg/l；
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述共培养培养基包括以下组分：1/2ms+2,4-d 1.0mg/l+柠檬酸150mg/l+半胱氨酸100mg/l+蔗糖10-15g/l+葡萄糖15-20g/l+乙酰丁香酮20mg/l；共培养条件为：22℃黑暗培养3d。
7.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：李纯佳，刘新龙，李旭娟，胡鑫，田春艳，覃伟，
申请(专利权)人：云南省农业科学院甘蔗研究所，
类型：发明
国别省市：
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