成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法技术

本发明专利技术公开了成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，包括如下步骤：含编码重组成纤维细胞生长因子家族蛋白载体的大肠杆菌菌株，在诱导时通过添加一定剂量单糖能促进胞内活性蛋白的表达。所述成纤维细胞生长因子家族蛋白包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15、FGF18、FGF21、FGF23蛋白及其突变体。在诱导时通过添加一定剂量单糖是指在加入诱导剂前补入单糖或与诱导剂同时补入单糖或加入诱导剂后补入单糖。克服了本技术领域关于葡萄糖抑制lac和ara操纵子在大肠杆菌重组的表达的技术偏见，提供一种能够高效促进成纤维细胞生长因子蛋白在大肠杆菌中的表达的方法。

【技术实现步骤摘要】
成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法
本专利技术涉及重组蛋白领域，具体具体涉及成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法。
技术介绍
成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowthFactor，FGF)是一类由Fgf基因家族成员编码的结构相关的蛋白质，对内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等多种中胚层和神经外胚层来源的细胞有促进DNA合成和细胞分裂作用，主要由成纤维细胞、内皮细胞、骨细胞、惰性细胞分泌，相对分子量一般在17～34kD(ItohN等，2004，TrendsinGenetics,20(11):563-569)。成纤维细胞生长因子包含23各成员，可以排列成7个亚家族，每个亚家族包含2-4个成员。Fgf1，Fgf4，Fgf7，Fgf8和Fgf9亚家族基因编码分泌的经典FGFs，其以肝素作为辅因子结合并激活成纤维细胞生长因子受体。Fgf15/19亚家族成员编码内分泌FGFs，其与Klotho家族蛋白质作为辅因子结合并激活FGFRs。Fgf11亚家族基因编码细胞内FGFs是非信号蛋白，作为电压依赖性钠离子通道的辅助因子(Ornitz等.2015，WileyInterdiscipRevDevBiol,4(3):215-266)。FGF已被美国伤口愈合协会和欧洲伤口管理协会推荐用于治疗难治性溃疡。自20世纪80年代初以来，Amgen，Merck和Lilly等世界知名制药公司已大力投资开发基于FGF的药物。FGF2，FGF-7和FGF-10已被证明在皮肤伤口愈合中是不可或缺的。2004年美国FDA批准了Amgen公司的一种FGF7(palifermin)静脉注射制剂，用于治疗骨髓移植白血病患者化疗引起的粘膜炎。FGF2被更广泛地用于伤口愈合，并且rh-FGF2显示出治疗压疮，糖尿病足溃疡和二度烧伤的潜在治愈效果。2000年，中国食品药品监督管理局批准使用rh-FGF2治疗慢性伤口。2001年在日本被批准用于治疗压疮和皮肤溃疡(烧伤溃疡和足溃疡)。FGF18在多种生理功能中起着关键作用，包括毛发生长和皮肤保持，皮质神经元活动(Hasegawa等，2004)，形态发生和血管生成(Ishibe等，2005)，以及骨骼生长和发育(Liuetal.2002；LongandOrnitz2013)。默沙东(MSD)的重组FGF18(Sprifermin)已在临床上用于治疗晚期骨关节炎(OA)患者，其临床I期临床试验已经完成，其中发现使用安全，减少了软骨损失并改善了软骨厚度；目前正在进行不同关节内Sprifermin剂量对膝关节原发性骨关节炎患者的疗效和安全性的II期试验。研究表明FGF21可以独立于胰岛素摄取葡萄糖,并与胰岛素有协同作用；可以显著降低血糖及血脂水平，改善胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能。随着研究的深入，FGF21将有望成为与胰岛素替代、竞争或联合用药的2型糖尿病治疗的一线药物(于聪等,2015，中国当代医药,(15):25-27)。目前美国礼来公司PEG化的FGF21已经进入II期临床试验阶段；美国安进公司(Amgen)的FGF-21同类产品也处于临床前研究阶段；美国Bristol-MyersSquibb和美国Am-brx也在2011年宣布将围绕FGF21蛋白合作开发系列治疗2型糖尿病的药物；中国李校堃教授团队的FGF21同类产品也处于临床前研究阶段。最新研究表明，FGF21也与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发病机制和治疗有关。美国BMS公司的聚乙二醇化FGF21类似物(PEG-FGF21，BMS-986036)2a期临床研究表明，NASH患者的脂肪变性减少，纤维化和肝损伤标志物得到改善(Kim,Kook等，2018，FrontiersinEndocrinology)。目前开始了用于评估BMS-986036在患有严重3期纤维化或肝硬化的人NASH患者中的安全性和功效的2b期临床研究。鉴于以上报道FGF蛋白在临床和生物医药领域具有较高应用和经济价值。FGF蛋白分子量小且无糖基化问题，适于原核表达，但是根据文献报道FGF蛋白在大肠杆菌体系中难以获得高效稳定的非融合可溶性表达(姜媛媛等，2009，生物化学与生物物理进展,36(2):157-164)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，解决了成纤维细胞生长因子蛋白在大肠杆菌体系中难以获得高效、稳定表达的技术问题。为实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，包括如下步骤：含编码重组成纤维细胞生长因子家族蛋白载体的大肠杆菌菌株，在诱导时添加单糖促进胞内活性蛋白的表达。进一步，所述成纤维细胞生长因子家族蛋白包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15、FGF18、FGF21、FGF23蛋白及其突变体。进一步，在诱导时添加单糖包括在加入诱导剂前补入单糖、与诱导剂同时补入单糖或加入诱导剂后补入单糖。进一步，所述的单糖的浓度范围为0.5-50g/L。进一步，单糖包括：三碳单糖、五碳单糖、六碳单糖、单糖衍生物。进一步，所述三碳单糖包括赤藓糖、苏糖；所述五碳单糖包括木糖、核糖、阿拉伯糖；六碳单糖包括葡萄糖、甘露糖、果糖；所述单糖衍生物包括L-鼠李糖、L-岩藻糖。进一步，所述的含编码重组FGF家族蛋白载体为T7启动子或BAD启动子调控的系列表达载体。进一步，所述的大肠杆菌菌株为适宜T7启动子或BAD启动子调控的表达载体的所有大肠杆菌。本专利技术提出在大肠杆菌重组表达FGF蛋白时加入一定剂量的单糖，例如葡萄糖，能够高效促进成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白在大肠杆菌中非融合、活性重组表达。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：一般认为葡萄糖会对启动子产生代谢阻遏，无论存不存在诱导物都会影响目标基因的表达，但是本专利技术通过加入一定量的葡萄糖能够促进成纤维细胞生长因子蛋白在大肠杆菌中非融合、活性重组高效表达，取得与现有技术产生相反的结果，这种促进表达的方法简便、有利于推广应用，使得成纤维细胞生长因子蛋白在生物医药和临床应用具有较好前景和经济价值。附图说明图1为实施例4中不同葡萄糖浓度促进重组FGF7变体诱导表达电泳图；图2为实施例5中不同糖促进重组FGF7变体诱导表达电泳图；图3为实施例6中葡萄糖促进重组FGF21表达电泳图；图4为实施例6中葡萄糖促进重组FGF18表达电泳图。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明：成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，包括如下步骤：含编码重组成纤维细胞生长因子家族蛋白载体的大肠杆菌菌株，在诱导时通过添加一定剂量单糖能促进胞内活性蛋白的表达。所述成纤维细胞生长因子家族蛋白包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15、FGF18、FGF21、FGF23蛋白及其突变体。在诱导时通过添加一定剂量单糖是指在加入诱导剂前补入单糖或与诱导剂同时补入单糖或加入诱导剂后补入单糖。所述的单糖的浓度范围为0.5-50g/L。单糖包括：三碳单糖、五碳单糖、六碳单糖、单糖衍生物。所述三碳单糖包括赤藓糖、苏糖；所述五碳单糖包括木糖、核糖、阿拉伯糖；六碳单糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：包括如下步骤：含编码重组成纤维细胞生长因子家族蛋白载体的大肠杆菌菌株，在诱导时添加单糖促进胞内活性蛋白的表达。

【技术特征摘要】
1.成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：包括如下步骤：含编码重组成纤维细胞生长因子家族蛋白载体的大肠杆菌菌株，在诱导时添加单糖促进胞内活性蛋白的表达。2.根据权利要求1所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子家族蛋白包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15、FGF18、FGF21、FGF23蛋白及其突变体。3.根据权利要求1或2所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：在诱导时添加单糖包括在加入诱导剂前补入单糖、与诱导剂同时补入单糖或加入诱导剂后补入单糖。4.根据权利要求3所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：所述的单糖的浓度范围为...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭长城，杨辉，李金星，何勇，曹宇，范开，
申请(专利权)人：重庆派金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50