细粒棘球绦虫高免卵黄抗体和试纸条及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及卵黄抗体及其制备方法和应用技术领域，是一种细粒棘球绦虫高免卵黄抗体和试纸条及制备方法和应用，该细粒棘球绦虫高免卵黄抗体，按下述方法进行：棘球绦虫抗原蛋白的制备，免疫原的制备，蛋鸡饲养及免疫，细粒棘球绦虫高免卵黄抗体的制备。本发明专利技术首次公开细粒棘球绦虫高免卵黄抗体、冻干高免卵黄抗体及其在诊断包虫病方面的应用，采用本发明专利技术所述细粒棘球绦虫高免卵黄抗体、冻干高免卵黄抗体制成的胶体金层析试纸条诊断包虫病时，所述胶体金层析试纸条具有很好的灵敏度、特异性、准确性和稳定性，为包虫病的诊断提供了一种更简单、成本更低的检测手段。

【技术实现步骤摘要】
细粒棘球绦虫高免卵黄抗体和试纸条及制备方法和应用
本专利技术涉及卵黄抗体及其制备方法和应用
，是一种细粒棘球绦虫高免卵黄抗体和试纸条及制备方法和应用，其包括一种细粒棘球绦虫高免卵黄抗体及其制备方法和其在制备诊断包虫病的试剂或试剂条或药物中的应用；还包括一种冻干高免卵黄抗体及其制备方法和其在制备诊断包虫病的试剂或试剂条或药物中的应用；还包括一种胶体金层析试纸条及制备方法和其在制备诊断包虫病的试剂盒中的应用。专利技术名称中的试纸条代表胶体金层析试纸条。
技术介绍
包虫病又称棘球蚴病，为人畜共患寄生虫病，严重危害人群健康甚至生命，由于传染源难于控制及缺乏高效防控措施，我国西部七省区仍为高流行区，部分地区人群包虫病患病率高达8.93％至12.38％，并呈现农牧业区向城区扩散，西北地区向东部和南部蔓延的趋势，目前已被国家列为重点控制的传染病之一。包虫病常由寄生于犬科动物小肠的细粒棘球绦虫虫卵或孕节随粪便排出污染草、饮水等，被人及家畜误食引起。随着包虫病防治规划的实施，诊断监测犬粪细粒棘球绦虫，是控制其在人畜间传播和免疫驱虫后防污染的必要手段。现有的病原检查漏诊率不断升高，且病原学检查费时、费力，操作烦琐，不适于现场大规模普查和疫情监测。因此，有必要建立一种简单快速、灵敏度高、经济的免疫学诊断方法，为综合防控包虫病提供重要工具，也为包虫病诊断提供一个新的技术手段和途径。免疫胶体金技术是免疫诊断中体外诊断的主要类型之一，其利用抗原与抗体互相结合的特异性反应来进行定性或定量的诊断，目前已广泛应用于临床诊断,尤其是在医学、兽医学临床检验中已广泛应用，具有费用低、灵敏度高、速度快、使用便捷、操作简单和易于普及等特点。在免疫学领域把通过使用特定抗原免疫产蛋母鸡(禽类)，使其淋巴细胞受免疫刺激后产生抗体IgY，而抗体IgY经血液选择性地转移到卵黄中并不断累积，称为卵黄免疫球蛋白(ImmunoglobulinofYolk，IgY)，为卵黄中唯一存在的抗体，也为禽类的一种特异性抗体，最终通过对卵黄液提取纯化获得特异性多克隆抗体。主要应用于疾病的诊断检测和防治、兽医临床、食品添加剂及化妆品领域等。然而，目前未有关于卵黄免疫球蛋白(卵黄抗体)用于包虫病诊断方面的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种细粒棘球绦虫高免卵黄抗体和试纸条及制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，本专利技术首次公开细粒棘球绦虫高免卵黄抗体在制备诊断包虫病的试剂或试剂条或药物中的应用，并且本专利技术的细粒棘球绦虫高免卵黄抗体用于诊断包虫病时，具有很好的灵敏度、特异性和稳定性。本专利技术的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种细粒棘球绦虫高免卵黄抗体的制备方法，按下述方法进行：第一步，棘球绦虫抗原蛋白的制备：采用0.9％灭菌生理盐水或浓度为0.01mol/L、pH值为7.2至7.4的灭菌PBS洗涤棘球绦虫虫体，将洗涤后的棘球绦虫虫体在液氮和37℃下反复冻融3次至5次，将冻融后的棘球绦虫虫体粉碎，再每1mg粉碎后的棘球绦虫虫体加50μL蛋白裂解液裂解后得到裂解液，将裂解液离心，离心后取上清液，将上清液过滤除菌，将除菌后的上清液中的蛋白浓度调整至1mg/mL后得到棘球绦虫抗原蛋白；第二步，免疫原的制备：将第一步得到的棘球绦虫抗原蛋白用浓度为0.01mol/L、pH值为7.2至7.4的灭菌PBS进行稀释后得到抗原蛋白稀释液，将抗原蛋白稀释液与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化后得到油包水弗氏完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原，将抗原蛋白稀释液与弗氏不完全佐剂混合并乳化后得到油包水弗氏不完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原；第三步，蛋鸡饲养及免疫：选择15周至20周龄健康的蛋鸡，第一次喂阿维菌素，将阿维菌素拌入饲料中，7天至10天后再次喂阿维菌素一次，蛋鸡每次喂阿维菌素量为0.2mg/公斤，阿维菌素两次喂食后，再经过7天至10天后，对无异常反应的蛋鸡进行首次免疫，首次免疫后，间隔10天至14天进行第二次免疫，第二次免疫后，间隔10天至14天进行第三次免疫，首次免疫使用油包水弗氏完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原1mL，非首次免疫使用油包水弗氏不完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原1mL，第三次免疫后，收集所得鸡蛋；第四步，细粒棘球绦虫高免卵黄抗体的制备：4.1将第三步所得鸡蛋消毒，再打破蛋壳，分离蛋清与蛋黄，将蛋黄倾于滤纸上，并通过滤纸将蛋黄上的蛋清吸除干净后得到蛋黄，在得到蛋黄的过程中，卵黄膜不破裂，然后刺破卵黄膜，将蛋黄中的卵黄原液倾入容器中得到卵黄原液，从鸡蛋得到卵黄原液的操作为无菌操作；4.2将卵黄原液用无菌的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS以1:5至10的比例进行稀释，然后室温搅拌混匀，再静置后离心分层，取第一上清液，向第一上清液中加入1％正辛酸溶液搅拌后冷冻16h至24h，抽滤后得到IgY初提液；4.3向IgY初提液中加入硫酸铵，使IgY初提液中的蛋白含量为20％，然后在-5℃至0℃下搅拌50min至80min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液一和沉淀一，向上清液一中加入硫酸铵，使上清液一中的蛋白含量为50％，然后在-5℃至0℃下搅拌30min至60min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液二和沉淀二，向上清液二中加入硫酸铵，使上清液二中的蛋白含量为80％，然后在-5℃至0℃下搅拌20min至40min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液三和沉淀三；4.4将4.3步骤中得到的沉淀一、沉淀二和沉淀三混合得到一次沉淀，将一次沉淀用与蛋黄等体积的无菌的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS溶解后得到溶解液，再用聚乙二醇6000沉淀溶解液中的卵黄抗体，再在-5℃至0℃下搅拌10min至30min，然后在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后离心得到二次沉淀；4.5将二次沉淀再用PBS重悬溶解后得到重悬溶解液一,然后在4℃条件下加入聚乙二醇6000沉淀重悬溶解液一中的卵黄抗体，再在-5℃至0℃下搅拌10min至30min，然后在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后离心得到三次沉淀；4.6将三次沉淀再用PBS重悬溶解得到重悬溶解液二，将重悬溶解液二以PBS作为透析液透析24h至48h后得到细粒棘球绦虫高免卵黄抗体，其中，前10小时每2h至3h更换一次透析液，之后每5h至6h更换一次透析液。本专利技术的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种细粒棘球绦虫高免卵黄抗体，按下述方法得到：第一步，棘球绦虫抗原蛋白的制备：采用0.9％灭菌生理盐水或浓度为0.01mol/L、pH值为7.2至7.4的灭菌PBS洗涤棘球绦虫虫体，将洗涤后的棘球绦虫虫体在液氮和37℃下反复冻融3次至5次，将冻融后的棘球绦虫虫体粉碎，再每1mg粉碎后的棘球绦虫虫体加50μL蛋白裂解液裂解后得到裂解液，将裂解液离心，离心后取上清液，将上清液过滤除菌，将除菌后的上清液中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细粒棘球绦虫高免卵黄抗体的制备方法，其特征在于按下述方法进行：第一步，棘球绦虫抗原蛋白的制备：采用0.9％灭菌生理盐水或浓度为0.01mol/L、pH值为7.2至7.4的灭菌PBS洗涤棘球绦虫虫体，将洗涤后的棘球绦虫虫体在液氮和37℃下反复冻融3次至5次，将冻融后的棘球绦虫虫体粉碎，再每1mg粉碎后的棘球绦虫虫体加50μL蛋白裂解液裂解后得到裂解液，将裂解液离心，离心后取上清液，将上清液过滤除菌，将除菌后的上清液中的蛋白浓度调整至1mg/mL后得到棘球绦虫抗原蛋白；第二步，免疫原的制备：将第一步得到的棘球绦虫抗原蛋白用浓度为0.01mol/L、pH值为7.2至7.4的灭菌PBS进行稀释后得到抗原蛋白稀释液，将抗原蛋白稀释液与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化后得到油包水弗氏完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原，将抗原蛋白稀释液与弗氏不完全佐剂混合并乳化后得到油包水弗氏不完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原；第三步，蛋鸡饲养及免疫：选择15周至20周龄健康的蛋鸡，第一次喂阿维菌素，将阿维菌素拌入饲料中，7天至10天后再次喂阿维菌素一次，蛋鸡每次喂阿维菌素量为0.2mg/公斤，阿维菌素两次喂食后，再经过7天至10天后，对无异常反应的蛋鸡进行首次免疫，首次免疫后，间隔10天至14天进行第二次免疫，第二次免疫后，间隔10天至14天进行第三次免疫，首次免疫使用油包水弗氏完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原1mL，非首次免疫使用油包水弗氏不完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原1mL，第三次免疫后，收集所得鸡蛋；第四步，细粒棘球绦虫高免卵黄抗体的制备：4.1将第三步所得鸡蛋消毒，再打破蛋壳，分离蛋清与蛋黄，将蛋黄倾于滤纸上，并通过滤纸将蛋黄上的蛋清吸除干净后得到蛋黄，在得到蛋黄的过程中，卵黄膜不破裂，然后刺破卵黄膜，将蛋黄中的卵黄原液倾入容器中得到卵黄原液，从鸡蛋得到卵黄原液的操作为无菌操作；4.2将卵黄原液用无菌的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS以1:5至10的比例进行稀释，然后室温搅拌混匀，再静置后离心分层，取第一上清液，向第一上清液中加入1％正辛酸溶液搅拌后冷冻16h至24h，抽滤后得到IgY初提液；4.3向IgY初提液中加入硫酸铵，使IgY初提液中的蛋白含量为20％，然后在‑5℃至0℃下搅拌50min至80min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液一和沉淀一，向上清液一中加入硫酸铵，使上清液一中的蛋白含量为50％，然后在‑5℃至0℃下搅拌30min至60min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液二和沉淀二，向上清液二中加入硫酸铵，使上清液二中的蛋白含量为80％，然后在‑5℃至0℃下搅拌20min至40min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液三和沉淀三；4.4将4.3步骤中得到的沉淀一、沉淀二和沉淀三混合得到一次沉淀，将一次沉淀用与蛋黄等体积的无菌的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS溶解后得到溶解液，再用聚乙二醇6000沉淀溶解液中的卵黄抗体，再在‑5℃至0℃下搅拌10min至30min，然后在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后离心得到二次沉淀；4.5将二次沉淀再用PBS重悬溶解后得到重悬溶解液一,然后在4℃条件下加入聚乙二醇6000沉淀重悬溶解液一中的卵黄抗体，再在‑5℃至0℃下搅拌10min至30min，然后在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后离心得到三次沉淀；4.6将三次沉淀再用PBS重悬溶解得到重悬溶解液二，将重悬溶解液二以PBS作为透析液透析24h至48h后得到细粒棘球绦虫高免卵黄抗体，其中，前10小时每2h至3h更换一次透析液，之后每5h至6h更换一次透析液。...

【技术特征摘要】
1.一种细粒棘球绦虫高免卵黄抗体的制备方法，其特征在于按下述方法进行：第一步，棘球绦虫抗原蛋白的制备：采用0.9％灭菌生理盐水或浓度为0.01mol/L、pH值为7.2至7.4的灭菌PBS洗涤棘球绦虫虫体，将洗涤后的棘球绦虫虫体在液氮和37℃下反复冻融3次至5次，将冻融后的棘球绦虫虫体粉碎，再每1mg粉碎后的棘球绦虫虫体加50μL蛋白裂解液裂解后得到裂解液，将裂解液离心，离心后取上清液，将上清液过滤除菌，将除菌后的上清液中的蛋白浓度调整至1mg/mL后得到棘球绦虫抗原蛋白；第二步，免疫原的制备：将第一步得到的棘球绦虫抗原蛋白用浓度为0.01mol/L、pH值为7.2至7.4的灭菌PBS进行稀释后得到抗原蛋白稀释液，将抗原蛋白稀释液与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化后得到油包水弗氏完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原，将抗原蛋白稀释液与弗氏不完全佐剂混合并乳化后得到油包水弗氏不完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原；第三步，蛋鸡饲养及免疫：选择15周至20周龄健康的蛋鸡，第一次喂阿维菌素，将阿维菌素拌入饲料中，7天至10天后再次喂阿维菌素一次，蛋鸡每次喂阿维菌素量为0.2mg/公斤，阿维菌素两次喂食后，再经过7天至10天后，对无异常反应的蛋鸡进行首次免疫，首次免疫后，间隔10天至14天进行第二次免疫，第二次免疫后，间隔10天至14天进行第三次免疫，首次免疫使用油包水弗氏完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原1mL，非首次免疫使用油包水弗氏不完全佐剂棘球绦虫蛋白免疫原1mL，第三次免疫后，收集所得鸡蛋；第四步，细粒棘球绦虫高免卵黄抗体的制备：4.1将第三步所得鸡蛋消毒，再打破蛋壳，分离蛋清与蛋黄，将蛋黄倾于滤纸上，并通过滤纸将蛋黄上的蛋清吸除干净后得到蛋黄，在得到蛋黄的过程中，卵黄膜不破裂，然后刺破卵黄膜，将蛋黄中的卵黄原液倾入容器中得到卵黄原液，从鸡蛋得到卵黄原液的操作为无菌操作；4.2将卵黄原液用无菌的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS以1:5至10的比例进行稀释，然后室温搅拌混匀，再静置后离心分层，取第一上清液，向第一上清液中加入1％正辛酸溶液搅拌后冷冻16h至24h，抽滤后得到IgY初提液；4.3向IgY初提液中加入硫酸铵，使IgY初提液中的蛋白含量为20％，然后在-5℃至0℃下搅拌50min至80min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液一和沉淀一，向上清液一中加入硫酸铵，使上清液一中的蛋白含量为50％，然后在-5℃至0℃下搅拌30min至60min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液二和沉淀二，向上清液二中加入硫酸铵，使上清液二中的蛋白含量为80％，然后在-5℃至0℃下搅拌20min至40min，再在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后再分层得到上清液三和沉淀三；4.4将4.3步骤中得到的沉淀一、沉淀二和沉淀三混合得到一次沉淀，将一次沉淀用与蛋黄等体积的无菌的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS溶解后得到溶解液，再用聚乙二醇6000沉淀溶解液中的卵黄抗体，再在-5℃至0℃下搅拌10min至30min，然后在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后离心得到二次沉淀；4.5将二次沉淀再用PBS重悬溶解后得到重悬溶解液一,然后在4℃条件下加入聚乙二醇6000沉淀重悬溶解液一中的卵黄抗体，再在-5℃至0℃下搅拌10min至30min，然后在4℃至5℃下以8000rpm/min至12000rpm/min的转速离心10min至20min后离心得到三次沉淀；4.6将三次沉淀再用PBS重悬溶解得到重悬溶解液二，将重悬溶解液二以PBS作为透析液透析24h至48h后得到细粒棘球绦虫高免卵黄抗体，其中，前10小时每2h至3h更换一次透析液，之后每5h至6h更换一次透析液。2.一种根据权利要求1所述的细粒棘球绦虫高免卵黄抗体的制备方法得到的细粒棘球绦虫高免卵黄抗体。3.一种根据权利要求2所述的细粒棘球绦虫高免卵黄抗体在制备诊断包虫病的试剂或试剂条或药物中的应用。4.一种使用根据权利要求2所述的细粒棘球绦虫高免卵黄抗体制备冻干高免卵黄抗体的方法，其特征在于按下述方法进行：步骤一，用MEST缓冲液清洗磁珠3次，然后将1ml至2ml磁珠加入1ml至2ml活化剂中震荡混合均匀，活化剂包括10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，再在室温条件下避光、转速为150r/min的条件下反应15min至1h，反应结束后静置5min至10min，用磁力架将反应后的磁珠分离出来得到活化磁珠，并弃去反应液的上清液，保留反应液的下层物，步骤二，将反应液的下层物用0.01mol/L、pH值为5.0至7.2的PBST缓冲液溶解得到下层物溶解液，采用下层物溶解液清洗活化后的磁珠...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩月红，温浩，王建华，高晓黎，段新宇，滕亮，赵军，高惠静，杨剑锐，孙其，何丽平，
申请(专利权)人：新疆医科大学第一附属医院，新疆医科大学，新疆维吾尔自治区包虫病临床研究所，
类型：发明
国别省市：新疆,65