本发明专利技术公开了一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤病人血浆外泌体miRNA的实时荧光定量PCR研究的新内参分子，序列是CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC，可避免不同标本在miRNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别，可以更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。
【技术实现步骤摘要】
一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA的PCR内参
本专利技术涉及一种适用于滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA实时荧光定量PCR研究的内参。
技术介绍
妊娠滋养细胞肿瘤(GestationalTrophoblasticNeoplasia,GTN)是一组来源于胎盘滋养细胞的恶性肿瘤。GTN进展极快，具有较强的亲血管性生物学特征，很早即可通过血液转移，对化疗极为敏感，是实体瘤中对化疗最敏感者，其治愈率已达80％～90％，但仍有约10％－20％患者因发生耐药而达不到治愈目的。目前GTN的临床治疗多以FIGO2000妊娠滋养细胞肿瘤分期与预后评分系统为指导，但对于GTN化疗效果的评估，特别是化疗耐药性的预测仍难以令人满意。随着分子医学的发展，寻找GTN早期诊断及耐药性预测的分子标志物，以便对GTN患者进行分层、针对性治疗，从而提高其治愈率，已成为GTN研究的关注点。外泌体(Exosome)是由细胞主动分泌的一种大小约为40～100nm、具有脂质双分子层膜结构的小囊泡。Exosome几乎在所有类型的体液中均可有效检测，外周血中同样存在Exosome，且肿瘤细胞在其发生发展的过程中会不断释放肿瘤特异性外泌体至胞外,并通过其携带肿瘤源性DNA、RNA及蛋白质等物质参与体内活动。2007年Valadi等第一次在外泌体中提取到miRNA。外泌体miRNA由于受到膜结构的保护，可免于RNA酶的降解，因而能够在体液循环和微环境中检测到，而其具有的肿瘤来源特异性的特点使其有望成为一种早期诊断与病情及疗效监控的方法。随着提取和分析方法的不断进步，目前已有众多报道将外泌体miRNA应用于临床诊治，以实现个体化的精准医疗。因此，在血浆外泌体内筛选出一个或多个与GTN初始化疗耐药相关miRNA也是一个令人期待的研究课题。但外周血外泌体miRNA目前尚无统一认可的内参miRNA。任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下有范围的恒定，在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的，盲目地使用内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能致错误甚至相反的结论，因此所研究组织的不同其选择的内参往往也不同。目前文献中用来实时荧光定量PCR外泌体miRNA的内参的分子主要有miR-16-5p、miR-21、U6等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出了一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子，可避免不同血浆标本外泌体miRNA的质量、产量以及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性和可靠性。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是：一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA的PCR内参，所述内参为has-miR-129-5p，序列是SEQIDNO.1所示的CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。进一步的，所述内参的正向引物的序列SEQIDNO.1所示的CTTTTTGCGGTCTGGGCTT。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提出了一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤病人血浆外泌体miRNA的实时荧光定量PCR研究的新内参分子，可以更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。附图说明图1本专利技术中，利用试剂盒提取的患者血浆中外泌体的电镜下形态。图2本专利技术中，利用试剂盒提取的患者血浆中外泌体的分子标记物的鉴定图。图3滋养细胞肿瘤患者血浆中外泌体内差异miRNA的表达谱图。图4滋养细胞肿瘤患者血浆中外泌体内miRNA质检图。图5miRNART-PCR产物琼脂糖电泳结果图。图6miRNART-PCR产物TA克隆测序结果图。图7外泌体内miRNAreal-timePCR引物扩增标准曲线(a)和溶解曲线图(b)。图8各候选内参分子滋养细胞肿瘤患者血浆中外泌体内的表达差异数据图。图9(a)和(b)候选内参基因进行geNorm分析结果图。具体实施方式：下面结合附图对本专利技术进行进一步的解释和说明：本专利技术共选用滋养细胞肿瘤患者标本65例。抽取病人血浆5ml置于ETDA管内，血浆的分离在采血后2h内完成，4000g10min4℃离心，取上层血浆分装至1.5mlEP管内，-80℃保存，直至使用，避免反复冻融。随机选取妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆20例(包括MTX敏感病人10例及耐药10例)。去除血浆内纤维蛋白原后，利用Exoquick(SBI)试剂盒提取血浆中外泌体，利用MiRNeasymicroKit(QIAGEN)提取外泌体miRNA，并用QubitmicroRNA试剂盒及AligentSmallRNAkit试剂盒对外泌体miRNA进行定量及质检鉴定。建立小RNA文库后，进行二代测序以及数据分析。对测序结果按照以下原则选择候选内参分子：(1)在妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体中均高表达的miRNA；(2)按照变异系数CV进行统计分析，选择在妊娠滋养细胞肿瘤MTX敏感及耐药患者血浆外泌体中表达无明显差异的miRNA；(3)在每个miRNA家族中选一最具有代表性的miRNA。目前荧光定量PCR外周血外泌体内miRNA内参分子主要有：小分子RNA(RNU6S)、miR-16-5p，miR-21等。合并二代测序结果及文献检索结果，最终选择以下分子作为本次研究的候选内参miR-129-5p、miR-320a、miR-127-3p、miR-99b-5p、miR-128-3p、miR-16-5p和U6。从miRBase数据库(http://microRNA.sanger.ac.uk)中获得所需要miRNA成熟体的序列，上海生工公司设计相应的加尾法引物。选取65例标本提取血浆内外泌体miRNA，经过定量及质检后，采用通用加尾法逆转录RNA及实时荧光定量PCR检测，并对PCR产物进行TA克隆并测序以确定其特异性。最后应用geNorm及Normfinder两个专用的内参分析软件进行数据分析，从而发现可适用于妊娠滋养细胞肿瘤血浆外泌体miRNA实时荧光定量PCR研究的内参分子。具体实验步骤及结果如下：1.标本的收集及分组：抽取妊娠滋养细胞肿瘤病人血浆5ml置于ETDA管内，血浆的分离在采血后2h内完成，4000g4℃离心10min，取上层血浆分装至1.5mlEP管内，-80℃保存，直至使用，避免反复冻融。滋养细胞肿瘤病人的入组、排除以及分组标准如下。滋养细胞肿瘤组患者入组标准(符合下列全部条件)：①签署知情同意书②临床诊断为妊娠滋养细胞肿瘤③没有接受放、化疗的初治病人(包括预防性化疗)④年龄20-45岁⑤体力分级：ECOG评分≥60分⑥血象(3天内)：WBC≥3.5×109/L，ANC≥1.5×109/L,Pt≥80×109/L,血清胆红素≤正常值高限的1.5倍，转氨酶≤正常值高限的1.5倍，BUN、Cr≤正常值高限⑦无严重内科合并症⑧患者能按方案要求接受随访排除标准：①临床未明确诊断妊娠滋养细胞肿瘤②病理诊断为中间型滋养细胞肿瘤，包括PSTT和ETT③已进行放、化疗者(包括预防性化疗)④有严重的或不能控制的内科疾患，不适合化疗者⑤1年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或接受过免疫治疗者分组标准：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA的PCR内参，所述内参为has‑miR‑129‑5p，序列是SEQ ID NO.1所示的CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。
【技术特征摘要】
1.一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA的PCR内参，所述内参为has-miR-129-5p，序列是SEQIDNO.1所示的CUUUUUGCG...
【专利技术属性】
技术研发人员：王新宇，沈夏梦，翁旸，吕卫国，谢幸，程晓东，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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