整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及到生物技术领域，具体涉及整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用，包括如下步骤：pTargetT‑X::PtetF18重组质粒的构建；通过整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株且表达展示在细胞表面。相对于现有技术，本发明专利技术的有益效果为：去除Nissle1917益生菌原有质粒，无抗性基因的存在；该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞（IPEC‑1）的粘附性能；口服免疫小鼠能产生免疫血清，即抗F18菌毛的IgG的抗体；口服免疫后小鼠血清能显著减低F18

Cloning, Construction and Application of Probiotic Strains Integrating Four Copies of Functional F18 pili Operator Gene

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to probiotic clones integrating four copies of functional F18 pili operon gene, construction method and application, including the following steps: construction of pTargetT X:: construction of PtetF18 recombinant plasmid; construction of probiotic clones integrating four copies of functional F18 pili operon gene, and obtaining four copies of non-resistant F18 pili gene integration. The cloned strain was displayed on the cell surface. Compared with the prior art, the beneficial effect of the invention is: removing the original plasmid of Nissle1917 probiotics and the existence of no resistance gene; the recombinant bacteria can effectively improve the adhesion of the porcine intestinal epithelial cells (IPEC 1); the oral immunized mice can produce immune serum, that is, the antibody against IgG of F18 pili, and the serum of mice can significantly reduce F18 after oral immunization.

【技术实现步骤摘要】
整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用
本专利技术涉及到生物技术应用领域，具体涉及到细菌的染色体整合、稳定遗传表达外源功能性F18菌毛蛋白。本专利技术利用CRISPR/cas9双质粒系统具有高效编辑细菌基因组(包括整合插入，敲除，点突变)的特性，且该CRISPR/cas9双质粒系统具有自身质粒去除简便和不残留抗性基因的机制。完成构建大肠杆菌益生菌Nissle1917无质粒克隆菌EcNc表面稳定携带四拷贝F18菌毛操纵子基因并遗传表达F18菌毛，并不影响宿主菌EcNc的自身生物学性状，该重组整合菌株制备有望成为构建抗F18+菌株引起的仔猪断奶后腹泻或水肿病益生菌活疫苗候选株的新方法，实现多功能重组益生菌活疫苗候选株的制备。
技术介绍
大肠杆菌Nissle1917是一株无致病性，至今并未发现对宿主有已知的害处影响，能给予不同宿主健康益处，且该菌株作为在欧洲上市的名为Mutaflor益生菌产品的主要活性成分，主要用于人类肠道健康调节。在临床应用上，益生菌Nissle1917菌株作为基因工程的载体被加以改造，该益生菌已用于疫苗、肿瘤治疗、保健品和诊断制剂等方面产品的开发与研制。EcNc克隆株为大肠杆菌Nissle1917原型野生株基因改造去除其胞内两个隐秘性质粒pMUT1和pMUT2，具备比亲本株携带更多(大)容量的同源或外源基因的特性，已在申请人实验室制备获得。为了实现微生物中同源或异源蛋白或化合物的过量表达生产，大多利用质粒的过表达，这种方法易于操作和调控的表达而被广泛使用，但这种方法存在遗传不稳定性。质粒的复制，抗生素抗性基因，过量表达以及其他异源基因等问题所带来的代谢负担会导致宿主细胞耗竭，产量损失甚至导致宿主细胞原始功能丧失。此外，为了维持细菌细胞中质粒的存在，须使用抗生素或其他选择性药剂，从而增加了整个生物加工的成本，同时也增加了耐药基因传播的几率。近年来，细菌染色体表达同源或异源基因在合成生物学和生物医学中越来越受青睐。在细菌染色体组整合同源或外源的DNA基因分子，常用的分子生物学方法包括使用转座子、噬菌体、核酸内切酶以及重组酶系统，常规的分子生物学方法在细菌染色体整合基因上具有一定的优势，但也都存在着自身的局限性，如长片段基因难以整合、效率低、脱靶率高等。本次申请专利所使用的方法为CRISPR/cas9双质粒系统对益生菌Nissle1917无质粒克隆株染色体进行外源大片段DNA基因片段(F18菌毛操纵子编码基因长约5.6Kb)的整合。断奶仔猪腹泻(PWD)和仔猪水肿病(ED)为养猪业临床上常见的细菌性疾病，主要病原菌为F4和F18菌毛阳性产肠毒素大肠杆菌ETEC，通过菌毛黏附、定植易感仔猪后感染发病，导致仔猪高死亡率，体重降低，生长缓慢，药物治疗费用昂贵等。临床上防治该疾病主要运用抗生素治疗，但随着养殖业生产中耐药菌的不断产生和累积，急需研究新的防控措施。本专利技术所构建的益生菌Nissle1917无质粒克隆菌EcNc稳定携带遗传且在菌体表面表达和展示功能性F18菌毛，有望为断奶仔猪腹泻或水肿病的防控提供新思路和策略。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术的目的在于提供整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因表达展示在Nissle1917益生菌克隆株细胞表面的构建方法及应用，利用益生菌Nissle1917无质粒克隆菌EcNc菌株染色体中四个非必需基因X(yjcS，pcadA，lacZ，yieN/trkD)内的位点，四拷贝整合并稳定表达F18菌毛，有望作为由F18+菌株引起的抗仔猪断奶后腹泻或水肿病的多功能重组益生菌活性疫苗候选株。为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.8.13，保藏编号为CGMCCNo.16253。整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因表达展示在Nissle1917益生菌克隆株细胞表面的构建方法，包括如下步骤：1)pTargetT-X::PtetF18重组质粒的构建；X表示EcNc染色体上特定基因的靶标位点；2)通过整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株。步骤2)具体为：pCas质粒电转化入益生菌EcNc中以构建EcNc/pCas重组菌株：制备EcNc/pCas感受态细胞(在第一轮待插入yjcS位点时选择EcNc/pCas感受态细胞；而第二轮开始，制备插入了yjcS位点的EcNc/pCas感受态细胞以使得在第二轮插入cadAp位点；而第三轮时，制备插入了yjcS、cadAp位点的EcNc/pCas感受态细胞；依此类推)，取EcNc/pCas感受态细胞(第一轮所用的感受态细胞为无插入的EcNc/pCas感受态细胞，第二轮，此感受态细胞为已经插入了yjcS位点的EcNc/pCas感受态细胞；第三轮，此感受态细胞为已经插入了yjcS，cadAp的EcNc/pCas感受态细胞，依此类推)与一种pTargetT-X::PtetF18重组质粒混合，对EcNc/pCas感受态细胞和pTargetT-X::PtetF18重组质粒组成的混合物进行电转化，电击产物置于冰冻的LB培养基孵育，之后于30℃摇床培养复苏，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB平板中于30℃培养过夜；挑取抗性平板上生长的可疑阳性克隆株病利用菌落PCR鉴定，若出现大于5600bp的条带，则证明整合成功，测序并确定是否获得了阳性单拷贝F18整合株，再去除抗性质粒；之后，进行下一次整合实验和去除抗性质粒操作，直至最终得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株。步骤2)中，去除抗性质粒的步骤为：将含有pCas和pTargetT-X::PtetF18质粒的EcNc菌株置于含卡那霉素和0.5mMIPTG的LB培养基中30℃摇床中培养14-18小时，之后挑取少许菌液于含卡那霉素的LB平板上划线，长出的单菌落于含壮观霉素的LB平板上划线以验证其对壮观霉素的敏感性，以验证是否去除了pTargetT-X::PtetF18质粒；去除pTargetT-X::PtetF18质粒后，最后再进行另外一个温度敏高型质粒pCas的去除，即将该EcNc菌株置于无抗性的LB培养基中于42℃中传代，直到最终得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株。此步骤2)中，每一轮的整合后，都要去除对应的pTargetT-X::PtetF18质粒，而质粒pCas的去除操作在最后一轮的整合完成并去除最后一轮的pTargetT-X::PtetF18抗性质粒后才进行。步骤1)具体为：利用pB032-X/pB033扩增引物从pTargetF质粒DNA模板中反向PCR扩增含有靶标位点X的N20序列的pTargetF-X线性化片段，随后对所得的线性化片段环化得到第一环化产物，第一环化产物转化入感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-X重组质粒；XupsteamHA-F/XupsteamHA-R和XdownsteamHA-F/X本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.8.13，保藏编号为CGMCC No. 16253。

【技术特征摘要】
1.整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.8.13，保藏编号为CGMCCNo.16253。2.整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因表达展示在Nissle1917益生菌克隆株细胞表面的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1）pTargetT-X::PtetF18重组质粒的构建；X表示EcNc染色体上特定基因的靶标位点；2）通过整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株。3.根据权利要求2所述的整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因表达展示在Nissle1917益生菌克隆株细胞表面的构建方法，其特征在于，步骤2）具体为：pCas质粒电转化入益生菌EcNc中以构建EcNc/pCas重组菌株，制备EcNc/pCas感受态细胞，取EcNc/pCas感受态细胞与一种pTargetT-X::PtetF18重组质粒混合，对EcNc/pCas感受态细胞和pTargetT-X::PtetF18重组质粒组成的混合物进行电转化，电击产物置于冰冻的LB培养基孵育，之后于30℃摇床培养复苏，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB平板中于30°C培养过夜；挑取抗性平板上生长的可疑阳性克隆株病利用菌落PCR鉴定，若出现大于5600bp的条带，则证明整合成功，测序并确定是否获得了阳性单拷贝F18整合株，再去除抗性质粒；之后，进行下一次整合试验和去除抗性质粒操作，直至最终得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株。4.根据权利要求3所述的整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因表达展示在Nissle1917益生菌克隆株细胞表面的构建方法，其特征在于，去除抗性质粒的步骤为：将含有pCas和pTargetT-X::PtetF18质粒的EcNc菌株置于含卡那霉素和0.5mMIPTG的LB培养基中30℃摇床中培养14-18小时，之后挑取少许菌液于含卡那霉素的LB平板上划线，长出的单菌落于含壮观霉素的LB平板上划线以验证其对壮观霉素的敏感性，以验证是否去除了pTargetT-X::PtetF18质粒；去除pTa...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国强，区炳明，金铎，夏芃芃，朱军，徐梦娴，宋浩亮，梁轩，杨颖，朱晓芳，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32