甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对及检测方法技术

甜瓜坏死斑点病毒是甜瓜生产上危害较为严重的一种病毒。本发明专利技术旨在建立该病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，具有高度特异性，而且没有发现与其他病毒的交叉反应。通过与RT‑PCR扩增结果比较发现RT‑LAMP对MNSV的敏感性比普通RT‑PCR的高10

Detection of melon necrotic spot virus by RT-LAMP

Melon necrosis spot virus is one of the most serious viruses in melon production. The invention aims to establish a reverse transcription loop mediated isothermal amplification detection method for the virus, which has high specificity and no cross reaction with other viruses. The sensitivity of RT LAMP to MNSV was 10% higher than that of RT PCR.

【技术实现步骤摘要】
甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对及检测方法
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对，还涉及甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测方法。
技术介绍
甜瓜又可称为香瓜、哈密瓜等，属葫芦科，一年生蔓性，草本植物。温带至热带地区广泛栽培，中国各地栽培亦分布广泛。甜瓜的重要之处也在于它是中国最早利用为果品的瓜类，《齐民要术》中称之为小瓜。甜瓜栽培历史悠久，品种类别多样，为盛夏的重要果实，有很高的经济价值，其果肉可生食，可制成瓜干、瓜脯、罐头，也可加工成瓜酒、瓜酱、腌甜瓜等。甜瓜在人们的生活中占据着重要地位，但甜瓜的产量和品质却或多或少的受到一些病害的影响，从而使甜瓜种植产业的经济效益有所减损，其中甜瓜病毒病便是影响甜瓜生产较严重的一种病害。甜瓜坏死斑点病毒(Melonnecroticspotvirus，MNSV)属于番茄从矮病毒科（Tombusviridae）香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)，该病毒已在国内外的报道中被多次提及。甜瓜坏死斑点病毒于1960年在日本首次报道，之后陆续传播到美国、希腊、瑞典、意大利和突尼斯等国，2007年中国首次报道了MNSV的发生。现在病毒的检测方法主要有血清学及分子生物学检测法，如酶联免疫吸附法（ELISA）、直接组织点免疫检测法（DTBIA）、逆转录PCR（RT-PCR）、实时荧光定量PCR和LAMP检测技术。目前，RT-LAMP方法已证明是诸多病原菌检测较为高效、快捷的一项技术，已广泛应用于人、动物、植物、病原微生物等方面的基因检测，为农业及其他方面的生产、科学研究提供了便捷途径。运用该方法进行病毒检测，不仅节约经济成本，而且能够节省时间及人力。在甜瓜坏死斑点病毒检测技术的建立过程中所展现的创新思维，也可能为其它研究提供灵感与借鉴。但目前尚未有使用RT-LAMP方法对甜瓜坏死斑点病毒进行检测的报道。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中甜瓜坏死斑点病毒RT-LAMP方法的空白，本申请提供了甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对。本专利技术还建立了甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对，外部引物对的核苷酸序列如下：MNSV-F3：5’-TCGGCTCCGTTTCACCTA-3’，MNSV-B3：5’-ACTTCCGGTCGACAGCATTA-3’。内部引物对的核苷酸序列如下：MNSV-FIP：5’-TGGGGAGGGGGTCTTGTGAATC-ACCGGATCTACTTCCACTGG-3’，MNSV-BIP：5’-TGCTCATTACGCTGACTCAGCG-CCTCCACGTATTGTCACACG-3’。检测引物对在进行非治疗目的的甜瓜坏死斑点病毒的检测中的应用。所述的应用，优选提取待检样品的总RNA，使用含有权利要求1中的检测引物对的反应体系进行扩增反应。所述的应用，优选反应体系为25μL体系，含有浓度均为10μM的MNSV-FIP和MNSV-BIP引物各1.6μL，浓度均为10μM的MNSV-F3和MNSV-B3引物各0.2μL，12.5μL2×RT-LAMP反应缓冲液，1μL的8U/μL的BstDNA聚合酶，1μL200U/μL的M-MuLV逆转录酶，1μL40U/μL的RNasin®RNA酶抑制剂，2μLRNA模板和不含RNase/DNase的ddH2O。所述的应用，优选2×RT-LAMP反应缓冲液，含有40mMTris-HCl(pH8.8)、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、16mMMgSO4、0.2％TritonX-100、2.4mMdNTP和1.6M甜菜碱。所述的应用，优选扩增反应条件为62℃、60分钟。所述的应用，优选RNA模板浓度检测限为0.75×10-5μg/μL。本专利技术的有益效果：1）建立了甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测方法，鉴于该法具有灵敏、可靠、快速的特点；2）RT-LAMP对于检测MNSV是高度特异性的，而其他病毒没有获得扩增产物。检测结果的比较显示，RT-LAMP对MNSV的敏感性比RT-PCR高103倍，而扩增和检测时间仅为后者的1/3；3）RT-LAMP技术只需更简单的设备和材料，因此MNSV的RT-LAMP检测技术在实际生产中具有更大的潜在价值，非常适合普通实验室和基层单位的大量样品检测。附图说明图1为MNSVRT-LAMP反应条件的优化，（A）温度对RT-LAMP反应的影响：（M：DL2000；1：60℃；2：61℃；3：62℃；4：63℃）；（B）时间对RT-LAMP反应的影响：（M：DL2000；1：30分钟；2：45分钟；3：60分钟；4：70分钟）；5：阴性对照。图2为MNSVRT-LAMP的特异性检验，（A）琼脂糖凝胶电泳对RT-LAMP的特异性分析；（B）在UV光下加入SYBRGreenI后的RT-LAMP可视化效果。M：DL2000；1：MNSV感染的甜瓜（寿光）；2：MNSV感染的甜瓜（昌乐）；3：CGMMV感染的黄瓜；4：CMV感染的黄瓜；5：CCYV感染的甜瓜；6：阴性对照。图3为MNSVRT-LAMP和RT-PCR的比较，（A）使用连续稀释的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳对RT-LAMP的灵敏度分析；（B）在UV光下添加SYBRGreenI的RT-LAMP可视化效果；（C）相同稀释度的总RNART-PCR琼脂糖凝胶检测结果。M：DL2000；1-8：MNSV感染甜瓜叶片中提取的总RNA模板浓度从0.75×100至0.75×10-7μg/μL作倍比稀释；9：阴性对照。图4为24个田间样品的电泳检测结果，（A）RT-LAMP方法检测结果；（B）RT-PCR方法检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：实施例11.1材料来源采集来自中国山东省寿光市、昌乐县感染甜瓜坏死斑点病毒（MNSV）的甜瓜叶片；已通过RT-PCR验证并储存在实验室中的黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV）和瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbitchloroticyellowsvirus，CCYV）。1.2引物的设计以MNSV基因组中的保守序列（GenBank登录号EU016217.1）为基础设计了一组RT-LAMP引物，包括外部引物（MNSV-F3和MNSV-B3）和内部引物（MNSV-FIP和MNSV-BIP）。设计的一对特异性引物MNSV-F/MNSV-R用于常规RT-PCR扩增（见表1）。所有引物均由Invitrogen（中国上海）合成。表1用于MNSV的RT-PCR和RT-LAMP的引物设计引物名称长度位置序列(5’-3’)MNSV-F201-20TCTACCTCTGCTAGCGAATCMNSV-R18656-673GGTGCTACCAGCACCAGAMNSV-F318397-414TCGGCTCCGTTTCACCTAMNSV-B320601-620ACTTCCGGTCGACAGCATTAMNSV-FIP42TGGGGAGGGGGTCTTGTGAATC-ACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甜瓜坏死斑点病毒的RT‑LAMP检测引物对，其特征在于：外部引物对的核苷酸序列如下：MNSV‑F3：5’‑ TCGGCTCCGTTTCACCTA ‑3’，MNSV‑B3：5’‑ ACTTCCGGTCGACAGCATTA ‑3’；内部引物对的核苷酸序列如下：MNSV‑FIP：5’‑ TGGGGAGGGGGTCTTGTGAATC‑ACCGGATCTACTTCCACTGG‑3’，MNSV‑BIP：5’‑ TGCTCATTACGCTGACTCAGCG‑CCTCCACGTATTGTCACACG ‑3’。

【技术特征摘要】
1.甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对，其特征在于：外部引物对的核苷酸序列如下：MNSV-F3：5’-TCGGCTCCGTTTCACCTA-3’，MNSV-B3：5’-ACTTCCGGTCGACAGCATTA-3’；内部引物对的核苷酸序列如下：MNSV-FIP：5’-TGGGGAGGGGGTCTTGTGAATC-ACCGGATCTACTTCCACTGG-3’，MNSV-BIP：5’-TGCTCATTACGCTGACTCAGCG-CCTCCACGTATTGTCACACG-3’。2.一种权利要求1中的检测引物对在进行非治疗目的的甜瓜坏死斑点病毒的检测应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于提取待检样品的总RNA，使用含有权利要求1中的检测引物对的反应体系进行扩增反应。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于反应体系为25μL体系，含有浓度均为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔宁，竺晓平，刘杰，张德珍，代惠洁，李金堂，张先平，
申请(专利权)人：潍坊科技学院，山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37