The invention discloses a method for creating rice germplasm resources with broad-spectrum blast resistance, in which rice varieties susceptible to blast are used as recipient materials. The method is site-directed substitution (A_G) of promoter region and 618 site of Bsr_d1 gene for rice varieties susceptible to blast, and site-directed substitution (A_G) of promoter region of Bsr_d1 gene is mediated by Agrobacterium tumefaciens. The site-specific substitution (A G) of promoter region 618 locus of Bsr D1 gene in the recipient variety was achieved by transgene method, and the double mutant plants were screened. The CRISPR / Cas9 gene substitution and gene site-specific insertion system were used to screen the negative progenies of transgenic rice after self-fertilization, i.e. the improved rice without transgene and with broad spectrum resistance to blast.
【技术实现步骤摘要】
一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法
:本专利技术农业生产
,具体涉及一农业生产的水稻种质资源生产领域,特别是一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法。
技术介绍
:水稻,是全世界最重要的粮食作物之一,在世界约一半人口是水稻作为口粮,稻瘟病是水稻主要病害之一,在业界被称为“水稻癌症”,可造成水稻大幅度减产,情况严重时,减产量可达30%~50%,甚至颗粒无收,据不完全统计全世界因稻瘟病而至水稻减产损失在1.6亿吨以上。因此提高水稻对稻瘟菌的抗性一直以来都是水稻抗病育种工作的重要问题。水稻对稻瘟病菌的抗性主要分为特异性抗性和非特异性抗性两种。特异性抗性,即利用水稻稻瘟病抗病(R)基因介导的对含有对应无毒基因的稻瘟菌生理小种所产生的抗性,这种抗性具有抗病效果强的特点,然而该抗性的局限在于范围狭窄且难以持久。由于稻瘟菌的毒性发生变异和优势小种的产生,通常抗病品种在推广3-5年后就丧失其抗性,也因此该抗性在农业生产上受到较大限制。非特异性抗性又称广谱抗性,能使水稻对几乎所有稻瘟病菌均具有良好的抗病效果,与特异性抗性相比具有不易被克服,田间效果持久的特点,具有更大应用价值。虽然人类在长期的农业生产中选择出少量具有广谱抗性的水稻材料,然而这类抗性背后的作用机制一直不清楚。最近,四川农业大学陈学伟教授课题组在Cell杂志发表研究论文,报道了利用广谱高抗水稻地谷与基因组已经测序的66份非广谱抗病水稻进行GWAS(全基因组关联)分析,并应用高抗水稻地谷与高感材料丽江新团黑谷为亲本构建的重组自交系,抗病性经多年田间自然诱发和苗期接种鉴定,进行共相关分析,鉴定到一个与广谱抗 ...
【技术保护点】
1.一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法,以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料,其特征是对稻瘟病感病水稻品种作为受体材料进行Bsr‑d1基因的启动子区域的定点替换(A→G),在进行Bsr‑d1基因的启动子区域‑618位点的定点替换(A→G)时,是通过农杆菌介导转基因手段实现对受体品种Bsr‑d1基因的启动子区域‑618位点的定点替换(A→G),并筛选获得该位点的双突变植株;采用CRISPR/Cas9基因替换以及基因定点插入体系,自交结实后筛选出转基因阴性后代,即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。
【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法,以稻瘟病感病水稻品种作为受体材料,其特征是对稻瘟病感病水稻品种作为受体材料进行Bsr-d1基因的启动子区域的定点替换(A→G),在进行Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换(A→G)时,是通过农杆菌介导转基因手段实现对受体品种Bsr-d1基因的启动子区域-618位点的定点替换(A→G),并筛选获得该位点的双突变植株;采用CRISPR/Cas9基因替换以及基因定点插入体系,自交结实后筛选出转基因阴性后代,即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。2.根据权利要求1所述的一种稻瘟病广谱抗性水稻种质资源创制方法,其特征是所述创制方法包括如下方法步骤:(1)CRISPR/Cas9介导定点替换靶位点的确定,在受体材料水稻Bsr-d1基因的启动子区域突变位点两侧各选取一个特异靶标片段,靶标片段的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构,(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx},N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个,NGG中的N为A、G、C、T中的任意一个;(2)构建两靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体,按照(1)步所述靶标片段的核酸排列顺序,构建用于水稻Bsr-d1基因的启动子区域打靶的两靶点CRISPR-Cas9重组载体,所述重组载体包括具有所述两个靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框;(3)构建替换片段供体载体,通过化学合成方法获得的与地谷启动子序列一致的替换DNA片段,而后连接到pCAMBIA1300载体上,为替换片段供体载体;(4)遗传转化利用基因枪介导法将(2)步已构建好的两靶点CRISPR基因编辑载体和(3)步替换片段供体载体共同转入受体材料水稻品种,获得不少于200株独立转化植株;(5)基因定点替换突变体植株检测CRISPR基因编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后,通过在目标靶位点侧翼设计特异引物扩增转基因植株靶位点,而后送样PCR产物和T载体克隆质粒进行测序,最终筛选出完成目标靶位点定点替换的双等位突变植株,为基因定点替换成功的突变体植株;(6)筛选不携带转基因成分的双等位突变水稻对于转基因手段获得的再生植株,选择双等位突变水稻T0再生株系,种植结实收获T1代种子,根据Cas9和潮霉素基因序列设计特异引物,筛选出T1代转基因阴性植株,为不携带Cas9和...
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