本发明专利技术公开了一种在水稻茎中特异表达的启动子的应用，属于植物基因工程领域。在水稻茎特异表达的启动子为OsNPF3.1基因的启动子，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过构建了启动子‑GUS转基因植株及GUS表达活性检测，发现该启动子是一个在茎中特异表达的启动子，能够启动下游基因在水稻的茎中特异性表达。将OsNPF3.1基因的启动子应用于转基因工程中，可在水稻营养生长阶段促进根部营养向叶片转运，在生殖生长阶段促进叶片营养物质通过茎杆向穗部的再分配，促进种子灌浆结实，也可以使其他目的基因的表达产物特异的在茎中积累，增加局部表达量，因此该启动子在转基因工程中有良好的应用前景。
Application of a Promoter Specifically Expressed in Rice Stems
The invention discloses an application of a promoter specifically expressed in a rice stem, belonging to the field of plant genetic engineering. The promoter specifically expressed in rice stems is OsNPF3.1 gene, and its sequence is shown as SEQ ID NO.1. The invention constructs a promoter GUS transgenic plant and detects GUS expression activity, and finds that the promoter is a promoter specifically expressed in the stem, and can activate the specific expression of downstream genes in the stem of rice. The application of OsNPF3.1 promoter in transgenic engineering can promote the transfer of root nutrients to leaves at the stage of rice vegetative growth, redistribution of leaf nutrients through stems to panicles at the stage of reproductive growth, seed filling and seed setting, and accumulation of expression products of other target genes in stems to increase local expression. It has good application prospects in genetically modified engineering.
【技术实现步骤摘要】
一种在水稻茎中特异表达的启动子的应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种在水稻茎中特异表达的启动子的应用。
技术介绍
赤霉素是一类双萜酸化合物，作为植物激素不但可以调控植物体内众多基因的表达，而且可以影响高等植物生活史的各个阶段，如种子萌发、茎的伸长、花器官的诱导和发育、种子和果实的形成等。赤霉素的生物合成具有明显的器官特异性，并受发育阶段控制。赤霉素的生物合成主要方式是控制赤霉素合成及分解相关的基因表达。如主要的控制点是后期阶段催化GA代谢的3个双加氧酶(GA20ox、GA2ox和GA3ox)[邢超，陈永胜，李跃等.赤霉素代谢和信息转导及其对植株表型的影响研究进展.安徽农业科学，2015,43(35):225-226]。赤霉素生物合成路径为：高等植物以3-磷酸甘油醛或丙酮酸为前体，首先在原质体内由环化酶催化形成贝壳杉烯；然后贝壳杉烯转移到内质网，在依赖细胞色素P450的单加氧酶的作用下转化成GA12-醛；最后转入细胞质由依赖2-酮戊二酸的双加氧酶催化成各种GAs最终产物[王荣.赤霉素信号转导的中间组分研究.生物学杂志，2007,24(2):5-8]。在植物中，GA的生物合成途径根据合成酶的特征被分为3个步骤：①GAS合成的前体——牻牛儿牻牛儿焦磷酸的形成途径；②GA12-7-醛的合成；③由GA12-7-醛合成其他GAS[袁高峰.赤霉素信号转导研究进展.细胞生物学杂志，2003,25(2):90-94]。赤霉素不仅可以调控种子的发芽、幼苗生长，还可以调控植物体内可溶性糖和可溶性蛋白质含量，进而调控C/N[戴忠良，潘跃平，肖燕等.不同浓度赤霉素处理对结球甘蓝抽薹和开花的影响.上海农业学报，2010,26(4):69-71]。如GA3处理可使君子兰叶片可溶性蛋白质和全氮含量降低[徐东昱，徐众帅.赤霉素对君子兰开花及可溶性糖和蛋白质含量的影响.安徽农业科学，2010,(14):7220-7222]。赤霉素通过对根尖茎向生长的负调控作用，来实现对根尖分身组织生长发育的负调控作用[钮世辉，李伟，陈晓阳.赤霉素对根尖径向生长的调节作用研究.北京林业大学学报，2013,35(3):71-76]。植物NPF家族是指能够介导2-3个氨基酸残基的小分子肽及硝酸根等物质进行跨膜运输的蛋白[RentschD,SchmidtS,TegederM.Transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.FEBSLet,2007,581:2281-2289]。NRT1/PTR家族成员参与了种子形成过程中蛋白质的积累和萌发中蛋白降解后小分子多肽形式转运[MartreP,PorterJR,JamiesonPD,etal.Modelinggrainnitrogenaccumulationandproteincompositiontounderstandthesink/sourceregulationsofnitrogenremobilizationforwheat.PlantPhysiol,2003,133:1959-1967]。已有研究表明水稻OsNPF3.1蛋白能够运输赤霉素[TalI,ZhangY,ME,etal.TheArabidopsisNPF3proteinisaGAtransporter.NatureCommunications,2016,7:11486]，但是到目前为止，关于OsNPF3.1基因对水稻的生物学影响没有任何报道。本专利技术发现OsNPF3.1基因的启动子序列能够启动基因在茎中特异表达，在基因工程应用中可以增加其他目的基因在茎中的局部表达量，特异的在茎中积累或者通过茎进行运输。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种在水稻茎特异表达的水稻NPF基因家族成员OsNPF3.1基因的启动子的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术以水稻的NPF基因家族成员OsNPF3.1基因的启动子为对象，首先将构建好的启动子-GUS表达载体通过农杆菌介导转化到水稻成熟胚诱导的愈伤组织中，得到转基因植株后鉴定阳性植株，继而得到T1代转基因植株，得到T2代成熟种子。然后在T2代种子生长的不同时期分别进行GUS组织化学染色，分别对其植株的根、叶鞘、茎、叶、穗等不同组织进行染色，检测GUS表达活性，分析其组织表达特异性。结果发现该启动子是一个在茎中特异表达的启动子，能够启动下游基因在水稻的茎中特异性表达。将该启动子应用于转基因工程中，可以使其他目的基因的表达产物特异的在茎积累，增加局部表达量。因此，OsNPF3.1基因的启动子在转基因工程中有良好的应用前景。一种OsNPF3.1基因的启动子在水稻中的应用，为该启动子能够启动下游基因在水稻茎中特异性表达。实现该应用的方法具体包括如下步骤：构建含该启动子-目的基因的表达载体，再将表达载体导入水稻中得到转基因水稻，目的基因能够在水稻茎中特异性表达，达到增加目的基因局部表达量的目的。所述的目的基因可以包括具有硝酸根运输功能的基因，如OsNPF6.5、OsNPF7.2等。所述的启动子序列如SEQIDNO.1所示，或为对SEQIDNO.1所示的序列进行取代、添加和/或缺失一个或几个核苷酸获得的不影响下游基因表达、具有同等功能的DNA序列。所述的表达载体的骨架载体优选为pCAMBIA-1391Z载体。本专利技术发现了OsNPF3.1基因的启动子能够启动下游基因在水稻的茎中特异性表达。将该启动子应用于转基因工程中，可在水稻营养生长阶段促进根部营养向叶片转运，在生殖生长阶段促进叶片营养物质通过茎杆向穗部的再分配，促进种子灌浆结实，也可以使其他目的基因的表达产物特异的在茎中积累，增加局部表达量，有良好的应用前景。附图说明图1是pCAM1391Z载体图。图2是转基因植株根(A)、叶鞘(B)、茎(C)、叶片(D)和穗(E)中GUS表达活性情况，图中的蓝色深，表示GUS表达活性高，说明启动子能够启动下游基因的表达。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步详细的说明，但本专利技术的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。实施例1OsNPF3.1基因的启动子-GUS转基因植株的构建提取水稻中花11的DNA，利用扩增引物F(ATAAGCTTACCTCCACCACCGAACCTCT，SEQIDNO.2)和扩增引物R(ATCCATGGCGTCTCCATTGCTGGTGCTTTGAT，SEQIDNO.3)通过PCR扩增OsNPF3.1基因的启动子序列后，利用HindIII、NcoI酶切连入pCAMBIA-1391Z载体，构建出启动子-GUS表达载体pOsNPF3.1-p1391Z。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，通过转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织将启动子-GUS表达载体导入正常水稻品种中花11中。将所有转基因小苗根部浸泡在50mg/L的潮霉素溶液72小时，叶子变卷的小苗为转基因阴性植株本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种OsNPF3.1基因的启动子在水稻中的应用，其特征在于：所述的应用为该启动子能够启动下游基因在水稻茎中特异性表达；所述的启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种OsNPF3.1基因的启动子在水稻中的应用，其特征在于：所述的应用为该启动子能够启动下游基因在水稻茎中特异性表达；所述的启动子的序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：构建含该启动子-目的基因的表达载体，再将表达载体导入水稻中得到转基因水稻，目的基因能...
【专利技术属性】
技术研发人员：方中明，吴博文，陈婷婷，赵一舟，黄慧霞，万芳伟，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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