本发明专利技术提供一种编码6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因pgdhD2来源于甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200，具有L‑丝氨酸抑制效应。以甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200为出发菌株，以同源双交换方法构建了pgdh基因缺失突变菌DMB，获得产L‑丝氨酸能力大大强于出发菌株Methylobacterium sp.MB200的L‑丝氨酸高产突变菌株，可耐受D‑丝氨酸浓度大大高于出发菌株。本发明专利技术提供的pgdh基因缺失突变菌在发酵法生产L‑丝氨酸生产上具有良好的应用前景。
A gene encoding 6-phosphogluconate dehydrogenase and its application
The present invention provides a gene encoding 6 phosphogluconate dehydrogenase and its application. Its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1. 6. The phosphogluconate dehydrogenase gene pgdhD2 originates from Methylobacterium sp. MB200 and has L serine inhibitory effect. Using Methylobacterium sp.MB200 as the starting strain, a mutant DMB with deletion of PGDH gene was constructed by homologous double exchange method. The mutant strain DMB with high L-serine production capacity was obtained, which was much stronger than the mutant strain of Methylobacterium sp.MB200. The mutant strain could tolerate D-serine concentration much higher than the mutant strain of Methylobacterium sp.MB200. The PGDH gene deletion mutant bacteria provided by the invention has good application prospect in the production of L serine by fermentation method.
【技术实现步骤摘要】
一种编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因及其应用。
技术介绍
L-丝氨酸具有重要的生理功能和应用价值，广泛应用于医药、食品和化工领域。目前，L-丝氨酸的生产方法主要有化学合成法、蛋白水解法、酶法转化和微生物发酵法。微生物发酵法生产L-丝氨酸是一种绿色、环保的生产方式，但由于存在反馈抑制调节作用，微生物很难大量积累L-丝氨酸，故微生物发酵法生产L-丝氨酸的产率相对较低，限制了该方法的应用。解除L-丝氨酸反馈抑制调节，提高发酵法生产L-丝氨酸产率的方法，一是通过对L-丝氨酸生物合成途径中关键的酶基因进行进化改造，获得具有抗L-丝氨酸反馈抑制调节的关键酶，解除L-丝氨酸的反馈抑制，构建L-丝氨酸高产菌株；二是改造非合成途径如EMP途径、HMP途径、L-丝氨酸转化途径、转运途径等的关键酶，也可以降低或解除L-丝氨酸反馈抑制，构建相关基因突变型L-丝氨酸高产菌株，解除L-丝氨酸的反馈抑制。解除L-丝氨酸对合成途径关键酶的反馈抑制是构建L-丝氨酸高产菌株的关键，基因进化改造是改造代谢途径关键酶及其基因表达调控序列的主要手段。已经有利用分子生物学技术进行相关研究以降低合成途径中关键酶对L-丝氨酸的敏感性，使得工程菌株具有抗L-丝氨酸反馈抑制调节以提高L-丝氨酸积累能力，提高生物合成L-丝氨酸的产率。如中国专利申请(公开号103436504A)公开了以L-丝氨酸产生菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062为出发菌株，采用基因组工程手段对催化其生物合成途径第一步反应的3-磷酸甘油酸脱氢酶进行进化改造，实现抗L-丝氨酸反馈抑制的3-磷酸甘油酸脱氢酶突变体的组成型稳定表达，获得稳定表达抗L-丝氨酸反馈抑制的3-磷酸甘油酸脱氢酶突变体，构建了L-丝氨酸高产菌株。中国专利(公开号1609208)公开了将大肠杆菌3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-PGDH)的第349位甘氨酸或第372位苏氨酸的取代，获得的突变体对L-丝氨酸的敏感降低，取得较好的效果。中国专利申请(公开号102433312A)同样采用定点突变，将3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-PGDH)第344位组氨酸突变为丙氨酸和第346位天冬酰胺突变为丙氨酸，突变体酶活不受L-丝氨酸抑制且酶活能够较大程度保留。甲基营养菌Methylobacteriumsp.MB200是从沼气池里的残渣中筛选分离出的一株产L-丝氨酸菌株，由于其可利用非C-C键的低碳复合物如甲醇生长，故而有区别于其他产丝氨酸微生物如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌的代谢途径。研究发现，在甲基营养菌如MethylobacteriumextorquensAM1中，具有如图1所示的复杂的代谢网络。由图1可知，在甲基营养菌中，甲醇先氧化为亚甲基四氢叶酸，然后与甘氨酸作用生成L-丝氨酸。甲基同化主要是通过C1途径和丝氨酸循环来实现的，而C1途径、丝氨酸循环又通过不同的碳化合物、辅酶、ATP等与EMP途径、HMP途径、TCA循环发生联系，形成一个相互影响、相互牵连并受到有序调控的代谢网络。甲基营养菌Methylobacteriumsp.MB200的L-丝氨酸生物合成处于这样的代谢网络中，同样也受到严格的调控，产物L-丝氨酸能够反馈抑制代谢网络中某些酶的活性，使L-丝氨酸生物合成处于抑制状态。为解除产物对合成途径中关键酶的反馈调节，通常采取的策略是选育抗代谢调节突变株，而选育产物结构类似物抗性突变株是该育种策略最常用的方法。利用质粒转座子插入技术构建突变体库，从中筛选出D-丝氨酸(L-丝氨酸结构类似物)抗性突变体，并克隆插入片断序列，可分析得到被突变的基因，该基因编码的酶即可能存在L-丝氨酸反馈调节作用。通过分析酶活性及其功能与L-丝氨酸的关系，可验证该酶是否具有该种反馈抑制作用。若获得的基因所编码的酶具有L-丝氨酸反馈抑制效应，则对该基因进行进化改造，构建突变菌株，可建立L-丝氨酸高产菌株。另外，甲基营养菌的代谢途径独特，代谢网络复杂，EMP、HMP、TCA、C1途径都与丝氨酸循环有千丝万缕的联系，通过上述方法可能克隆得到不同于目前发现的具有L-丝氨酸反馈抑制效应的酶(如3-PGDH)的基因。通过构建重组菌和酶活实验，分析相关基因功能及其与产L-丝氨酸的关系，构建相关基因突变型菌株，解除甲基营养菌L-丝氨酸反馈抑制调节，获得L-丝氨酸高产菌株，将为构建L-丝氨酸高产菌株提供新思路、新途径。
技术实现思路
针对甲基营养菌Methylobacteriumsp.MB200发酵产L-丝氨酸存在反馈抑制调节、产率相对较低等问题，本专利技术利用质粒转座子插入技术构建甲基营养菌Methylobacteriumsp.MB200的突变体库，筛选出一种具有D-丝氨酸抗性的突变体，克隆出具有L-丝氨酸抑制效应的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH)基因，并构建pgdh基因缺陷型的L-丝氨酸高产菌株，解除甲基营养菌代谢过程中6-PGDH对产L-丝氨酸的抑制作用，从而提高L-丝氨酸的产量。本专利技术提供的技术方案为：一种编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因pgdhD2，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术的技术方案中，所述的编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因pgdhD2，其核苷酸序列SEQIDNO:1中的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到第993个核苷酸以终止密码子TGA结束，存在一个完整的开放阅读框(ORF)，自5’端的第1-3位核苷酸为pgdhD2基因的起始密码子ATG，自5’端的第991-993位核苷酸为pgdhD2基因的终止密码子TGA。本专利技术的技术方案中，所述的编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因pgdhD2，其核苷酸序列SEQIDNO:1中的开放阅读框(ORF)，共有993个核苷酸，可编码由330个氨基酸组成的蛋白质。本专利技术还提供了一种由所述的编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因pgdhD2编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。一种包含编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因pgdhD2序列的表达载体。一种缺失编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因pgdhD2序列的甲基营养菌Methylobacteriumsp.MB200突变体细胞系。本专利技术还提供了所述的编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因pgdhD2在构建缺失编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因pgdhD2的产L-丝氨酸突变型菌种中的应用。本专利技术采用的方法具体操作如下：(1)甲基营养菌Methylobacteriumsp.MB200耐受D-丝氨酸突变体基因的克隆与分析方法：通过质粒转座子插入技术构建甲基营养菌Methylobacteriumsp.MB200的突变体库，从中筛选出具有D-丝氨酸抗性的突变体。对突变体提取总DNA，经酶切后连接到克隆载体pMD-18T上，导入到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，利用双抗性在平板上挑取转化子，并提取质粒，酶切验证后进一步测序，在NCBI中进行Blast序列比对和分析，得出突变体插入片段为甲基营养菌Methylobacteriumsp.MB200耐受D-丝氨酸的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因。(2)6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活分析：依据Methylobacteriumsp.MB200的6-磷酸葡本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种编码6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因pgdhD2在构建缺失编码6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因pgdhD2的产L‑丝氨酸菌种中的应用，所述菌种的出发菌种为Methylobacteriumsp. MB200，其特征在于：所述基因pgdhD2核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因pgdhD2在构建缺失编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因pgdhD2的产L-丝氨酸菌种中的应用，所述菌种的出发菌种为Methylobacteriumsp.MB200，其特征在于：所述基因pgdhD2核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因pgdhD2在构建缺失编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因pgdhD2的产L-丝氨酸菌种中的应用，所述菌种的出发菌种为Methylobacteriumsp.MB200，其特征在于：所述基因pgdhD2核苷酸序列SEQIDNO:1中的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始...
【专利技术属性】
技术研发人员：申佩弘，武波，李献，蒋承建，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45
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