一种检测尿嘧啶糖苷酶（UDG）活性的生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于纳米金颗粒团聚产生表面增强拉曼散射效应检测尿嘧啶糖苷酶活性的生物传感器，及其制备方法。针对比色检测精度低、荧光检测易漂白等问题，本发明专利技术通过修饰于纳米金颗粒表面的发夹核酸探针做底物实现了快速、灵敏、安全的UDG酶活性检测，采用表面增强拉曼散射（SERS）技术实现超灵敏、精准检测，同时本发明专利技术还提供了该生物传感器的制备方法，该方法在均相溶液中进行，条件温和，易于操作。

A biosensor for detecting the activity of uracil glycosidase (UDG) and its preparation method

The invention relates to the field of biosensor technology, in particular to a biosensor for detecting uracil glycosidase activity based on surface enhanced Raman scattering effect produced by agglomeration of gold nanoparticles, and a preparation method thereof. Aiming at the problems of low accuracy of colorimetric detection and easy bleaching of fluorescence detection, the invention realizes fast, sensitive and safe UDG enzyme activity detection by using hairpin nucleic acid probe modified on the surface of gold nanoparticles as substrate, and realizes ultra-sensitive and accurate detection by using surface enhanced Raman scattering (SERS) technology. At the same time, the invention also provides the preparation method of the biosensor. Homogeneous solution, mild conditions, easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
一种检测尿嘧啶糖苷酶（UDG）活性的生物传感器及其制备方法
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及基于纳米金颗粒团聚产生表面增强拉曼散射效应检测尿嘧啶糖苷酶活性的生物传感器，及其制备方法。
技术介绍
自1974年Lindahl等首次报道了大肠杆菌提取物中UDG（尿嘧啶糖苷酶）的活性以来，UDG的研究越来越受到关注。UDG是一种单体蛋白，分子量在25Kda左右，广泛存在于各类原核生物和真核生物中。作为碱基损伤修复蛋白的主要成员，UDG能够特异性识别DNA单链或双链中的尿嘧啶残基，并可以水解其与脱氧核糖之间的N-糖苷键，从而剔除尿嘧啶，生成一个无碱基位点（AP位点）。内切核酸酶Ⅳ和外切核酸酶Ⅲ识别该AP位点后，切断此处磷酸二酯键，生成3’羟基与5’磷酸基团，然后与DNA聚合酶、DNA连接酶、磷脂酶一并完成碱基切除修复，从而保证DNA序列的完整性。传统的检测UDG活性方法有聚合酶链反应片段长度多态性检测、酶链免疫检测、放射性标签和HPLC等方法，然而，以上这些方法受到放射性物质、昂贵的仪器设备以及复杂耗时等缺陷限制，很难普遍化。为了克服以上缺陷，一些基于比色和荧光的UDG活性检测策略发展起来，这些新技术给UDG活性检测方面带来了巨大的进步，但是比色检测精度偏低；荧光则需要修饰荧光染料，价格比较昂贵，而且容易光漂白（见光分解），这就对操作过程要求比较苛刻。
技术实现思路
针对比色检测精度低、荧光检测易漂白等问题，本专利技术提供了检测UDG活性的生物传感器，采用表面增强拉曼散射（SERS）技术实现超灵敏、精准检测，同时本专利技术还提供了该生物传感器的制备方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：一种检测尿嘧啶糖苷酶UDG活性的生物传感器，包括1条DNA发夹探针、金纳米颗粒、均相反应液；所述的DNA发夹探针，其序列如SEQIDNo:1所示，5’-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACUCTGCTGTTTTTTCAGCAGAGTG-3’。一种上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）将发夹探针修饰到金纳米颗粒表面；（2）均相反应液中UDG酶切反应；（3）拉曼强度分析：通过检测溶液的拉曼散射光谱进行UDG活性的检测。所述步骤（1）的步骤为：S1取3nM纳米金溶液；边搅拌边加入拉曼染料溶液，使拉曼染料的浓度为2μM；S2室温放置20-40min，加入的修饰了-SH的发夹探针，混合均匀后，将标记溶液存于冰箱放置；S3按照2~3μl/次缓慢加入PB缓冲液，搅拌5-15min后，然后加入PBS缓冲液；将标记溶液存于冰箱放置；S4将标记好的纳米金溶液加入灭菌水，离心去除上清液；再加入灭菌水离心，此过程重复两次，保证将未标记的核酸链彻底去除。最后得到标记有发夹探针的纳米金溶液。所述的拉曼染料为4-对硝基苯硫酚浓度为：0.05-0.45nM；所述的修饰了-SH的发夹探针的加入量与纳米金的摩尔比为5000:1。所述的PB缓冲液加入量为使其终浓度为10mMPB。所述的PBS缓冲液含10mM常规磷酸缓冲液（PB）及2MNaCl，加入后使NaCl的终浓度是0.3M。所述步骤（2）均相反应液中UDG酶切反应，操作步骤如下：J1配置均相溶液：将标记有发夹探针的纳米金溶液、限制性核酸内切酶IV、外切酶I、NEBuffer和待测物尿嘧啶糖苷酶（UDG）混合，得到均相溶液；J2UDG酶切反应：将J1得到的均相溶液震荡，放入37℃的水浴锅中反应；将反应好的溶液从水浴锅中取出，取反应液10μL用拉曼光谱仪进行检测。所述步骤J1中均相溶液中纳米金的终浓度为0.25nM，限制性核酸内切酶IV的终浓度为2U/mL；外切酶I终浓度为2U/mL，10×NEBuffer终浓度为2μL，尿嘧啶糖苷酶（UDG）的加入浓度为0.1U/mL。所述的DNA发夹探针的结构为：以上结构图是通过核酸模拟软件模拟出的发夹结构图，可以看出，本专利技术中设计的核酸发夹无其它二级构象，并且Tm值为74.1℃，在37℃均相反应溶液中构象稳定。在将5’端修饰了巯基的发夹探针DNA链中设计了一个尿嘧啶位点U，然后通过Au-S键将发夹探针修饰到纳米金颗粒的表面；当有目标物UDG存在时，UDG就会特异性识别并切割尿嘧啶位点U，从而在发夹DNA中产生一个无碱基位点（AP位点）；随后，限制性核酸内切酶IV特异性的识别发夹探针中的AP位点并进行切割，使发夹探针转变成DNA单链；最后，由外切酶I特异性的依次水解修饰在纳米金颗粒上的DNA单链，致使纳米金颗粒失去了核酸链保护，在高盐缓冲液中团聚，产生表面等离子体共振效应，极大的增强金纳米颗粒表面电磁场强度，使标记在纳米金颗粒表面的拉曼染料产生表面增强拉曼散射（SERS）效应，在特定的位置出现拉曼光谱；当反应液中不存在UDG时，无法对发夹探针中的尿嘧啶特异性的切割，从而无法进行后续的纳米金团聚的反应，进而没有标记染料的拉曼散射光谱产生。反应结束后，取10μL产物溶液滴在硅片上使用激光共聚焦拉曼光谱仪对其进行拉曼光谱扫描。本专利技术的原理是修饰在金纳米颗粒表面的发夹探针茎中含有一个脱氧尿嘧啶碱基，能够被UDG切除；含有脱碱基位点的发夹探针随后又被核酸内切酶IV水解，产生一条单链结构；随即被外切酶I催化水解；从而使纳米金表面失去核酸链的保护，在一定盐浓度环境中失去表面保护的纳米金团聚，产生很强的局域电磁场增强，从而使其表面修饰的染料产生增强的拉曼信号，从而得到被检测样品的UDG酶的活性。并且针对不同水平的被检测样品，根据不同的拉曼信号值反映出不同的酶活性而进行定量分析。本专利技术的有益效果：本专利技术通过修饰于纳米金颗粒表面的发夹核酸探针做底物实现了快速、灵敏、安全的UDG酶活性检测，与之前的UDG酶活性检测方法对比有如下优点：（1）精度高：依靠纳米金团聚增强SERS信号，实现了超灵敏检测UDG酶活性；（2）检测快：无需复杂的样品前处理步骤，大大缩短了检测时间；（3）无干扰：选择仅有拉曼指纹的染料标记，避免了荧光背景干扰，有效的提高了信背比。附图说明图1为该实验的原理图；图2为优化拉曼染料后的信背比；图3为UDG酶浓度与拉曼强度关系曲线图。具体实施方式以下结合附图及实施例对本专利技术的技术方案进一步详细描述。以下实例不构成对本专利技术的限定。图1是本专利技术的原理图。如图1所示，底物探针（纳米金颗粒表面修饰了发夹探针和拉曼染料）、核酸内切酶IV、外切酶I和UDG37度温浴60分钟后，纳米金颗粒失去核酸链保护团聚，产生拉曼信号。通过拉曼信号的强度来确定目标物UDG酶的浓度。实施例1纯的UDG浓度检测1.将拉曼染料和发夹探针DNA修饰到金纳米粒子表面：a、取1mL纳米金溶液于离心管中，离心10min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至3nM。移入1mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口，加入12μL浓度为0.25nM的拉曼染料（4-NTP）。b、室温放置30min后，加入150μL浓度为30μM的修饰了-SH的底物探针（发夹DNA），混合均匀后，4℃下放置24h。c、分多次缓慢加入50μLPB缓冲液(常规磷酸缓冲液100mM，pH=7.4)，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10min后，继续加入27μLPBS缓冲液。取出磁子，4℃放置48h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测尿嘧啶糖苷酶（UDG）活性的生物传感器，其特征在于，包括1条DNA发夹探针、金纳米颗粒、均相反应液；所述的DNA发夹探针，其序列如SEQ ID No:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测尿嘧啶糖苷酶（UDG）活性的生物传感器，其特征在于，包括1条DNA发夹探针、金纳米颗粒、均相反应液；所述的DNA发夹探针，其序列如SEQIDNo:1所示。2.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将发夹探针修饰到金纳米颗粒表面；（2）均相反应液中UDG酶切反应；（3）拉曼强度分析：通过检测溶液的拉曼散射光谱进行UDG活性的检测。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的步骤为：S1取3nM纳米金溶液；边搅拌边加入拉曼染料溶液，使拉曼染料的浓度为2μM；S2室温放置20-40min，加入的修饰了-SH的发夹探针，混合均匀后，将标记溶液存于冰箱放置；S3按照2~3μl/次缓慢加入PB缓冲液，搅拌5-15min后，然后加入PBS缓冲液；将标记溶液存于冰箱放置；S4将标记好的纳米金溶液加入灭菌水，离心去除上清液；再加入灭菌水离心，此过程重复两次，保证将未标记的核酸链彻底去除。4.最后得到标记有发夹探针的纳米金溶液。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的拉曼染料为4-对硝基苯硫酚浓度为：0.05-0.45nM；根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，王海旺，黄加栋，刘素，王敬锋，张雪，宋晓蕾，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37