一种促进牛卵母细胞成熟的miRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公示了一种miRNA‑378及其应用，所述miRNA‑378在不同大小的牛卵泡中差异表达，通过验证，发现miRNA‑378抑制剂能够促进牛卵母细胞成熟。基于此，本发明专利技术还公开了包含所述miRNA‑378抑制剂的培养基，用于培养牛卵母细胞，以及相应的促进牛卵母细胞成熟的方法。本发明专利技术公开的miRNA及其应用对提高牛体外胚胎的生长发育具有重要意义。

A MicroRNAs Promoting Bovine Oocyte Maturation and Its Application

The invention discloses a kind of microRNA378 and its application. The microRNA378 is differentially expressed in bovine follicles of different sizes. Through verification, it is found that the inhibitor of microRNA378 can promote bovine oocyte maturation. Based on this, the present invention also discloses a culture medium containing the inhibitor of microRNA378 for bovine oocyte culture and a corresponding method for promoting bovine oocyte maturation. The disclosed microRNAs and their applications are of great significance for improving the growth and development of bovine embryos in vitro.

【技术实现步骤摘要】
一种促进牛卵母细胞成熟的miRNA及其应用
本专利技术属于卵母细胞培养领域，具体地，涉及一种促进牛卵母细胞成熟的miRNA及其应用。
技术介绍
外泌体于1983年首次在绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。外泌体为直径在40～100nm的盘状囊泡，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。当外泌体被发现后，一度被认为是细胞排泄废物的一种方式，随着对外泌体研究的不断深入，包括对其生物来源、分布、物质构成及运输和细胞间信号传导的研究，发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能根据来源细胞类型的不同，可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明来源肿瘤细胞的外泌体参与肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息交换，从而导致大量新生血管生成，促进肿瘤的生长与侵袭。MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中的一类内源性、具有调控功能的非编码RNA。miRNA长约20～25个核苷酸，成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的。miRNAs组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。目前，针对外泌体miRNA在细胞上的研究主要是外泌体miRNA参与细胞迁移、分化、增殖等过程中，但是对于外泌体miRNA在牛体外胚胎培养中的作用尚未有太多研究。
技术实现思路
为了解决上述技术问题的至少一种，本专利技术的第一方面提供一种促进牛卵母细胞成熟的miRNA-378，其特征在于，所述miRNA-378的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术的第二方面提供本专利技术第一方面所述的miRNA-378在预测牛卵母细胞成熟速度中的应用。在本专利技术的一些实施方案中，在牛卵母细胞培养过程中，测定卵母细胞中miRNA-378的表达水平，当表达水平低于参考水平，代表卵母细胞成熟速度快。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述参考水平是根据大量快速成熟的牛卵母细胞中miRNA-378的表达水平确定的。本专利技术的第三方面提供本专利技术第一方面所述的miRNA-378在制备用于培养牛卵母的培养基中的应用，其特征在于，所述培养基包含一定量的miRNA-378抑制剂。在本专利技术的一些实施方案中，所述一定量是指80nmol/L～160nmol/L，在本专利技术的一些优选实施方案中，所述一定量是指120nmol/L。本专利技术的第四方面提供一种培养牛卵母细胞的培养基，其特征在于，包含本专利技术第一方面所述的miRNA-378的抑制剂。在本专利技术的一些实施方案中，所述一定量是指80nmol/L～160nmol/L，在本专利技术的一些优选实施方案中，所述一定量是指120nmol/L。本专利技术的第五方面提供一种促进牛卵母细胞成熟的方法，包括向培养基中添加一定量的本专利技术第一方面所述的miRNA-378的抑制剂的步骤。在本专利技术的一些实施方案中，所述一定量是指80nmol/L～160nmol/L，在本专利技术的一些优选实施方案中，所述一定量是指120nmol/L。本专利技术的有益效果本专利技术利用下一代测序得到能够促进牛卵母细胞成熟的miRNA，进一步通过培养验证，miRNA-378抑制剂能够促进牛卵母细胞成熟，这对提高牛体外胚胎的生长发育具有重要意义。附图说明图1示出了miRNA-378在不同大小卵泡中差异表达的聚类分析。图2示出了realtimePCR验证miRNA-378在不同大小卵泡中的表达差异。具体实施方式为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本专利技术的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表专利技术人发现的可以用于实施本专利技术的技术，因此可以视为实施本专利技术的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本专利技术的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本专利技术所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的专利技术的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。实施例1测序法鉴定能够促进牛卵母细胞成熟的miRNA在屠宰场收集卵巢后，放入37℃、加有青链霉素的生理盐水中4-6h内带回试验室。用预热的生理盐水将收集的卵巢冲洗3遍，去除杂质和血水，并用剪刀剔除卵巢表面的脂肪块、结缔组织和输卵管等，用生理盐水将修剪后的卵巢再清洗一遍。将处理后的卵巢放入加有双抗的生理盐水烧杯中，置于37℃恒温台上备用。然后用10mL注射器(带有8号针头)对卵巢表面直径2-8mm大小的卵泡内容物进行抽吸。将牛卵巢卵泡按照直径大小分为大(>8mm)、中(2-8mm)、小(<2mm)三组，分别将卵泡液移至90mm培养皿中，体视显微镜下用口吸管收集卵丘-卵母细胞复合体(COCs)捡卵后卵泡液1500r/min离心5min取上清液用0.22μm微孔滤器过滤后-80℃冰箱冻存；利用外泌体提取试剂盒提取三组卵泡液中的外泌体，然后使用Trizol法提取外泌体中的RNA，利用下代测序技术(NGS)分析不同卵泡液来源的miRNA的表达水平。结果如图1和表1所示，1条miRNA在不同大小的卵泡中差异表达，名称为miRNA-378，序列为5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC-3’(SEQIDNO:1)。表1miRNA-378在不同组中差异表达实施例2用real-timePCR技术检测牛卵母细胞中的表达水平利用外泌体提取试剂盒和Trizol法提取两组卵泡的RNA，逆转录得到cDNA。以转录得到的以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每个待测基因每个模板设置三个复孔，在冰上操作。按照两步法PCR设定反应步骤。反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照公式得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。结果如图2所示，miRNA-378在不同组细胞中差异显著，其中在小卵泡组表达水平最高，其次是中卵泡组，大卵泡组表达水平最低。实施例3miRNA-378在促进牛卵母细胞成熟中的应用分别合成miRNA-378agomir(类似物)和miRNA-378antagomir(抑制剂)两种化合物。其中Agomir是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA，通过模拟内源性的miRNA来调节靶基因的生物学功能。antagomir是根据miRNA成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA，是专门用于抑制内源性microRNA的高效抑制剂。通过脂质体包裹(TAKALA试剂盒)的方式将miRNA类似物添加到牛卵母细胞体外成熟培养液中：将3μL的miRNA和3μL的transfection分别与22μL的buffer混合后，再将这两者混合物静置20min，滴入450μL的牛卵母细胞体外成熟培养基中摇匀(终浓度为120nnol/L)，培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进牛卵母细胞成熟的miRNA‑378，其特征在于，所述miRNA‑378的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种促进牛卵母细胞成熟的miRNA-378，其特征在于，所述miRNA-378的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的miRNA-378在预测牛卵母细胞成熟速度中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在牛卵母细胞培养过程中，测定卵母细胞中miRNA-378的表达水平，当表达水平低于参考水平，代表卵母细胞成熟速度快。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述参考水平是根据大量快速成熟的牛卵母细胞中miRNA-378的表达水平确定的。5.权利要求1所述的miRNA-378在制备用于培养牛卵母的培养基中的应用，其特征在于，所述培养基包含一定量的权利要求1所述的m...

【专利技术属性】
技术研发人员：滑留帅，吕晨晨，王二耀，王璟，王之保，柏中林，辛晓玲，施巧婷，陈付英，徐照学，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41