生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基技术

本发明专利技术涉及麦角硫因的生物合成制备方法和发酵培养基，该方法包括如下步骤：步骤1：将猴头菌(Hericium erinaceus)菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中培养，获得种子液；步骤2：将获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质培养，通过pH判断发酵至发酵终点，获得发酵液；步骤3：发酵结束后，加入酶，酶解至终点，升温灭酶，将菌丝体的细胞内的麦角硫因浸提至细胞外的发酵液中。利用本发明专利技术的方法，能够提高麦角硫因的产量，可快速简便地判断发酵终点，减少发酵副产物的产生，使用酶破碎菌丝体细胞，麦角硫因浸提完全。

Biosynthesis of ergothione and its fermentation medium

The invention relates to a biosynthetic preparation method of ergothione and a fermentation medium. The method comprises the following steps: step 1: inoculate the oblique strain of Hericium erinaceus mycelium into liquid seed medium to obtain seed liquid; step 2: inoculate the obtained seed liquid into fermentation medium to ferment and add precursor substance to culture, and judge fermentation to germination by pH value. Step 3: After the end of fermentation, adding enzyme, enzymatic hydrolysis to the end point, heating and deactivating enzyme, extracting ergothione from mycelium cells into extracellular fermentation broth. By using the method of the invention, the production of ergothione can be increased, the end point of fermentation can be judged quickly and simply, the production of fermentation by-products can be reduced, the mycelium cells can be broken by enzymes, and ergothione can be completely extracted.

【技术实现步骤摘要】
生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基
本专利技术涉及利用猴头菌菌丝体生物合成麦角硫因的方法和用于其的发酵培养基，属于微生物发酵工程领域。
技术介绍
麦角硫因(ergothioneine，EGT)，学名为2-巯基-L-组氨酸三甲基内盐，其分子结构中含有以下通式(1)所示咪唑-2-硫酮基团。麦角硫因是存在于很多动植物体内，含量丰富的一种天然氨基酸，不能由动物机体自身合成，只能从食物中摄取，属于稀有氨基酸。有研究表明，麦角硫因具有强抗氧化特效，还可以保护细胞免受紫外线和γ射线所导致的细胞损伤甚至死亡，因此在医药、食品和化妆品等行业具有广泛的应用前景。但是麦角硫因在绝大多数生物体中的含量均极少，且动物不能自身合成麦角硫因，只能通过食物获得。而进一步研究表明，许多微生物如真菌和放线菌都能够合成麦角硫因，因此利用生物发酵技术合成麦角硫因越来越受到人们的重视。目前，关于麦角硫因的研究越来越多，如专利文献1公布了“生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法”，其特征在于利用糙皮侧耳CGMCCNo.6232发酵合成麦角硫因，并通过搅拌、加热方式将麦角硫因从菌丝体细胞内浸提到水溶液中，但是这种浸提方式可能会造成菌丝体细胞破裂不充分，麦角硫因没有完全释放到胞外。非专利文献1中提到，利用液态深层培养方式进行杏鲍菇菌丝体培养生产麦角硫因，并对发酵最适温度、接种量、起始pH值、碳源、氮源、氨基酸等进行探讨优化，最终发酵产量可到62.20mg/L。而辅酶在生物催化反应中必不可少，在发酵培养基中添加适量辅酶，有时会利于目的产物的产生，如果非专利文献1中在杏鲍菇菌丝体发酵时能添加合适的辅酶，可能会大大提高麦角硫因的产率。非专利文献2中提到，利用香菇菌丝体液态深层发酵生产麦角硫因，产率可达3.45mg/gDW，折算成发酵液中麦角硫因含量为23.6mg/L。专利文献2公布了“麦角硫因的生物合成制备方法”，其特征在于利用大型真菌的菌丝体在装有培养基的三角瓶中液态发酵，再将发酵液经过加热、搅拌，使菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，得到花脸香蘑的麦角硫因最高产量为51mg/L，肺形侧耳的最高产量为48mg/L，野生紫孢侧耳的最高产量为37mg/L。综上所述，目前生物合成制备麦角硫因主要存在以下问题：1、发酵产率较低，生产成本较高，无法大规模生产利用；2、判断发酵终点的方法不明确。如果采用定期取样，处理后进行液相检测麦角硫因含量是否继续增高的方法判断，过程复杂，且终点判断不够及时。若为使麦角硫因充分合成而一味延长发酵时间，务必会增加其他发酵副产物，为后期纯化处理带来困难；3、麦角硫因从菌丝体细胞内浸提到细胞外的方式多采用搅拌、加热的方式，细胞破碎可能不完全，麦角硫因不能完全浸出，造成浪费，且搅拌、加热能耗较高，从而增加了生产成本。现有技术文献专利文献专利文献1:CN103734022A专利文献2:CN103184246A非专利文献非专利文献1:黄龄谊，高麦角硫因含量之杏鲍菇菌丝体深层培养及其生理活性[D].台湾：中兴大学，2010.非专利文献2:PramvadeeTepwongetal.Mycobialenhancementofergothioneinebysubmergedcultivationofediblemushroommyceliaanditsapplicationasanantioxidativecompoundcompound[J].FoodChemistry，2012，131：247～258
技术实现思路
本专利技术人为了解决上述问题，本专利技术提供了一种麦角硫因的生物合成制备方法及其发酵培养基，通过利用猴头菌CCTCCNo：M2018567菌丝体液体深层发酵而制备麦角硫因。具体来说，本专利技术涉及以下内容。1、一种麦角硫因的生物合成制备方法，所述方法包括如下步骤：将猴头菌(Hericiumerinaceus)菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中培养，获得种子液；将获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质培养，通过pH判断发酵至发酵终点，获得发酵液；以及发酵结束后，加入酶，酶解至终点，升温灭酶，将菌丝体的细胞内的麦角硫因浸提至细胞外的发酵液中。2、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述猴头菌为猴头菌(Hericiumerinaceus)CCTCCNo：M2018567。3、根据项1所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养5～10天，获得种子液。4、根据项1所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养7～15天，获得发酵液。5、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下组分：1～10％(w/v)蔗糖、1～5％(w/v)的豆饼粉、0.01～1％(w/v)的磷酸二氢钠，0.01～1％(w/v)的硫酸钠，pH4.0～6.0。6、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：2～6％(w/v)碳源、1～3％(w/v)的有机氮源、0.01～1％(w/v)的无机盐、0.0001～0.001％(w/v)的微量元素，0.0001～0.001％(w/v)的辅酶，pH4.0～6.0。7、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述前体物质包括以下一种或多种的组合：半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甜菜碱。8、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，发酵终点时发酵液pH≥6.0，残糖为0。9、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶包括以下一种或多种的组合：崩溃酶、蜗牛酶、透明质酸酶、溶壁酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶，进一步优选为蜗牛酶和崩溃酶。10、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的碳源包括以下的一种或多种的组合：可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、玉米粉、半乳糖、麦芽糊精。11、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的氮源包括以下的一种或多种的组合：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、黄豆粉、小麦蛋白胨、豆饼粉、豆粕、麸皮、酪蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、大豆肽粉、尿素。12、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的无机盐包括以下的一种或多种的组合：氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。13、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的微量元素包括以下的一种或多种的组合：硫酸锰、氯化亚铁、氯化锌、氯化锰、硫酸亚铁。14、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的辅酶包括以下的一种或多种的组合：生物素、烟酸、磷酸吡哆醛、维生素B6、维生素B12、核黄素、维生素B1。15、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的组成为：2～6％(w/v)葡萄糖、1～3％(w/v)的牛肉膏、0.01～0.05％(w/v)的磷酸二氢钠、0.01～0.05％(w/v)硫酸钠、0.0001～0.001％(w/v)的氯化锌，0.0001～0.001％(w/v)的烟酸，其余为水。16、根据项1～15中任一项所述的制备方法，还包括将酶解后的发酵液离心，取上清液过滤，得到麦角硫因提取液的步骤。17本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种麦角硫因的生物合成制备方法，所述方法包括如下步骤：将猴头菌(Hericium erinaceus)菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中培养，获得种子液；将获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质培养，通过pH判断发酵至发酵终点，获得发酵液；以及发酵结束后，加入酶，酶解至终点，升温灭酶，将菌丝体的细胞内的麦角硫因浸提至细胞外的发酵液中。

【技术特征摘要】
1.一种麦角硫因的生物合成制备方法，所述方法包括如下步骤：将猴头菌(Hericiumerinaceus)菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中培养，获得种子液；将获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质培养，通过pH判断发酵至发酵终点，获得发酵液；以及发酵结束后，加入酶，酶解至终点，升温灭酶，将菌丝体的细胞内的麦角硫因浸提至细胞外的发酵液中。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猴头菌为猴头菌(Hericiumerinaceus)CCTCCNo：M2018567。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养5～10天，获得种子液。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养7～15天，获得发酵液。5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下组分：1～10％(w/v)蔗糖、1～5％(w/v)的豆饼粉、0.01～1％(w/v)的磷酸二氢钠，0.01～1％(w/v)的硫酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏玉洁，陆震，贾玉倩，孙元军，陈雯雯，石艳丽，栾贻宏，郭学平，
申请(专利权)人：华熙福瑞达生物医药有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37