一种背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法技术

本发明专利技术公开了一种背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，包括：对瓯江彩鲤进行人工授精和胚胎显微注射，对eomesa1和eomesa2基因同时进行基因敲除，经基因敲除效率检测合格获得基因突变瓯江彩鲤F0嵌合体；待所述瓯江彩鲤F0性成熟后进行内交获得eomesa1和eomesa2双突变纯合体，即背鳍缺失的瓯江彩鲤纯合体；将上述双突变纯合体大规模培育亲鱼并生产，即得背鳍缺失瓯江彩鲤商品鱼；上述方法解决传统选择育种方法中存在基因突变随机且频率很低，可选择的遗传资源少，很难获得目标性状基因突变的问题，可以丰富观赏鱼养殖对象，增加养殖收益。

A Method of Making Oujiang Coloured Carp with Loss of Dorsal Fin

The invention discloses a method for preparing Oujiang color carp with dorsal fin missing, which includes: artificial insemination and embryo microinjection of Oujiang color carp, simultaneous gene knockout of eomesa1 and eomesa2 genes, qualified detection of gene knockout efficiency to obtain the F0 chimerism of Oujiang color carp, and double mutant homozygous of Oujiang color carp F0 after sexual maturity. The homozygote of Oujiang colour carp with dorsal fin deletion is the homozygote of Oujiang colour carp. The homozygote of Oujiang colour carp with dorsal fin deletion can be cultured and produced on a large scale, and the commercial fish of Oujiang colour carp with dorsal fin deletion can be obtained. Increase the benefits of farming.

【技术实现步骤摘要】
一种背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法
本专利技术涉及鱼类的制种方法，具体涉及一种背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法。
技术介绍
目前，鱼类育种方法有很多种，如：家系选择育种、杂交育种、分子辅助育种、雌核发育、雄核发育和多倍体育种等，传统鱼类育种方法在观赏鱼上的应用已经非常广泛，尤其用于金鱼和锦鲤中，已经育成许多优质品种。但是，新育种技术的应用却非常滞后，主要源于金鱼和锦鲤小而散的生产方式，缺少必要的研究思路和技术路线，类似地，七彩神仙鱼、孔雀鱼、剑尾鱼、神仙鱼等其它观赏鱼类的育种方法也都处于同等水平。背鳍缺失的金鱼称为“蛋种”金鱼，是金鱼中极具观赏价值的一类金鱼，观赏鱼选择育种时一般以观赏性经济性状作为预定的育种目标，在群体自然变异的基础上，经多代选择优良表型的个体，得到新品种。但是，在自然条件下物种基因突变频率很低，可供选择的遗传变异范围很小，获得新性状的概率很低，且基因突变具有偶然性和随机性，很难获得目标性状的基因突变。因此，对多数观赏鱼来说目前采用的育种技术有限，传统的育种方法耗时过长，效率不高。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，根据设定的育种目标，通过对控制某一性状的基因进行人工突变，采用高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术实现瓯江彩鲤背鳍的缺失，精准地对背鳍形成的调控基因进行操作，快速获得目标性状，解决传统选择育种方法中存在基因突变随机且频率很低，可选择的遗传资源少，很难获得目标性状基因突变的问题。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，包括：先对瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因同时敲除，人工授精和胚胎显微注射，经基因敲除效率检测合格获得基因突变瓯江彩鲤F0嵌合体；待所述瓯江彩鲤F0性成熟后进行内交获得eomesa1和eomesa2双突变纯合体；即背鳍缺失的瓯江彩鲤纯合体将上述eomesa1和eomesa2双突变纯合体大规模培育亲鱼并生产，即得背鳍缺失瓯江彩鲤商品鱼；其中，所述瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因同时敲除时采用T7体外转录启动子的靶点，其序列转录起始位点的前两位为GG，靶序列长度为19bp或20bp，GC含量高，没有连续AT和回文结构。优选地，所述靶点序列的第三位为G或A。优选地，所述靶点序列为GGACGCGCGGAAAAGTTCTC(SEQIDNO.1)、GGGCTCCGCGGCGAGGGCGC(SEQIDNO.2)或GGCGCATTATAACGTGTTTG(SEQIDNO.3)。优选地，所述靶点序列合成时采用T7启动子，且上游引物为：T7promoterTargetsitescaffoldTAATACGACTCACTATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQIDNO.4)；下游为通用引物tracrrev：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’(SEQIDNO.5)。优选地，所述的瓯江彩鲤人工授精和胚胎显微注射方法为：人工授精前将收集的新鲜精子和卵子分开暂时放置于4℃冰箱保存，显微注射前取一个装满养殖水的深桶，在桶底铺满干净的培养皿，把收集到的精子和卵子经过干法授精后，迅速均匀撒入桶内，在重力作用下大多数受精卵动物极朝上、植物极朝下粘附于培养皿上，捞取培养皿，在显微注射仪下对受精卵(1细胞胚胎)进行注射；且注射时每个靶点的gRNA和Cas9蛋白按浓度比为1～1.25:10混合，每枚胚胎注射混合液1nL，每个靶点共注射约500枚胚胎，即得。优选地，所述的瓯江彩鲤基因敲除效率检测时，先设计特异性引物，针对每个靶点序列设计2对特异性上下游引物，分别扩增eomesa1和eomesa2基因组序列片段；其中，针对靶点序列为GGACGCGCGGAAAAGTTCTC(SEQIDNO.1)的上、下游引物分别为ACATGGACCGGACTGAAACCGA(SEQIDNO.6)和CTGTCCGAACTGATACCCGCTC(SEQIDNO.7)、ACATGGACCGGACTGAAACCGA(SEQIDNO.8)和GTCCAAACTGATAGCCGCTTCC(SEQIDNO.9)；针对靶点序列为GGGCTCCGCGGCGAGGGCGC(SEQIDNO.2)的上、下游引物分别为GACCAATCCGTGCTCTCTCTTC(SEQIDNO.10)和CGGGTTCGTTTTTATCACCCTT(SEQIDNO.11)、CACCAACCCGTGCTCTCTCTTT(SEQIDNO.12)和GAACGGATTCGGGTTCATTT(SEQIDNO.13)；针对靶点序列为GGCGCATTATAACGTGTTTG(SEQIDNO.3)的上、下游引物分别为GGCAGGTGAGAATGAGAAGCTG(SEQIDNO.14)和AGTTTGCATGTAGCCTGTGTT(SEQIDNO.15)、GGGCAGGTAAGAATGAAAACTTG(SEQIDNO.16)和AACTGGTTGTCATGATGCTC(SEQIDNO.17)。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术对瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因同时敲除，精准地对背鳍形成的调控基因进行操作，目标和表型明确，可以直接获得背鳍形成的调控基因突变的瓯江彩鲤F0嵌合体；待瓯江彩鲤F0性成熟后(两年)进行内交获得eomesa1和eomesa2双突变纯合体，即背鳍缺失的瓯江彩鲤纯合体；获得纯合突变体后大规模培育亲鱼，进行背鳍缺失瓯江彩鲤即“蛋种”瓯江彩鲤的生产，丰富观赏鱼养殖对象，增加养殖收益。附图说明图1为瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因结构、敲除靶点位置及氨基酸序列相似性比较；其中，a)eomesa1和eomesa2基因结构，T1、T2和T3为基因敲除靶点位置；b)eomesa1和eomesa2两个基因编码区核苷酸序列和蛋白序列的相似性，两个旁系同源基因编码区核苷酸序列相似性为94％，氨基酸序列相似性为96％，获得两个基因的外显子核酸序列用于基因敲除靶点设计。图2为瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因敲除Sanger法测序检测；其中，a)靶点T1敲除后检测eomesa1和eomesa2基因相对于未敲除序列(WT)碱基插入缺失情况；b)靶点T2敲除后检测eomesa1和eomesa2基因相对于未敲除序列碱基插入缺失情况；c)靶点T3敲除后检测eomesa1和eomesa2基因相对于未敲除序列碱基插入缺失情况。图3为瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2嵌合体F0背鳍表型与斑马鱼eomesa突变体表型比较。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。参见图1，通过基因编辑技术将瓯江彩鲤基因组中的斑马鱼eomesa直系同源基因eomesa1和eomesa2(两个旁系同源基因编码区核苷酸相似性为94％，氨基酸相似性为96％[图1b])同时进行破坏，可以获得同样的表型。根据瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因结构和基因序列相似性情况，在第一和第二个外显子上设计3个基因敲除靶点，即T1、T2和T3(图1a，表1)，每个靶点可以同时对eomesa1和eomesa2进行敲除。参见图2，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，其特征在于，包括：先对瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因同时敲除，人工授精和胚胎显微注射，经基因敲除效率检测合格获得基因突变瓯江彩鲤F0嵌合体；待所述瓯江彩鲤F0性成熟后进行内交获得eomesa1和eomesa2双突变纯合体；即背鳍缺失的瓯江彩鲤纯合体；将上述eomesa1和eomesa2双突变纯合体大规模培育亲鱼并生产，即得背鳍缺失瓯江彩鲤商品鱼；其中，所述瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因同时敲除时采用T7体外转录启动子的靶点，所述靶点序列转录起始位点的前两位为GG，靶序列长度为19bp或20bp，GC含量高，没有连续AT和回文结构。

【技术特征摘要】
1.背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，其特征在于，包括：先对瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因同时敲除，人工授精和胚胎显微注射，经基因敲除效率检测合格获得基因突变瓯江彩鲤F0嵌合体；待所述瓯江彩鲤F0性成熟后进行内交获得eomesa1和eomesa2双突变纯合体；即背鳍缺失的瓯江彩鲤纯合体；将上述eomesa1和eomesa2双突变纯合体大规模培育亲鱼并生产，即得背鳍缺失瓯江彩鲤商品鱼；其中，所述瓯江彩鲤eomesa1和eomesa2基因同时敲除时采用T7体外转录启动子的靶点，所述靶点序列转录起始位点的前两位为GG，靶序列长度为19bp或20bp，GC含量高，没有连续AT和回文结构。2.根据权利要求1所述的背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，其特征在于，所述靶点序列的第三位为G或A。3.根据权利要求1或2所述的背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，其特征在于，所述靶点序列如SEQIDNO.1-3所示。4.根据权利要求1所述的背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，其特征在于，所述靶点序列采用T7启动子，且上游引物序列如SEQIDNO.4所示；下游为通用引物，序列如SEQIDNO.5所示。5.根据权利要求1所述的背鳍缺失瓯江彩鲤的制种方法，其特征在于，所述的瓯江彩鲤人工授精和胚胎显微...

【专利技术属性】
技术研发人员：任建峰，宋诗颖，崔文耀，李伟明，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31