一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒及其应用。所述主要包括以下试剂：DMEM培养基、0.25％胰酶、0.2％Ⅰ型胶原酶、PBS溶液、胎牛血清、鸡胚提取物、青霉素和链霉素混合液。本发明专利技术试剂盒包含了鸡原代成肌细胞培养所需的所有试剂，可特异性培养鸡原代成肌细胞。试剂盒中鸡胚提取物为本产品特有的细胞培养营养物质，结合DMEM培养基和胎牛血清，可最大限度的提供鸡成肌细胞生长所需的各类营养成分。所培养的鸡原代成肌细胞形态饱满、均一，繁殖活力强。

【技术实现步骤摘要】
一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒及其应用(一)
本专利技术涉及一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒及其应用。(二)
技术介绍
成肌细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞，来源于中胚层干细胞，在胚胎发育过程中先由间充质细胞分化为成肌细胞，然后分裂、融合成多核肌纤维，形成肌小管，再进一步分化为成熟的骨骼肌细胞。成肌细胞具有自我更新和促进肌纤维再生的能力。目前的科研工作中要求研究者从实验动物中分离和培养原代的成肌细胞。研究发现，成肌细胞不仅分离和分化非常困难，成功率低，而且少数存活下来的成肌细胞生长极其缓慢，易发生凋亡。(三)
技术实现思路
本专利技术目的即是提供一种可特异性培养鸡原代成肌细胞，且所培养的鸡原代成肌细胞形态饱满、均一，繁殖活力强的原代鸡成肌细胞培养试剂盒，及其应用。本专利技术采用的技术方案是：一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒，主要包括以下试剂：DMEM培养基、0.25％胰酶、0.2％Ⅰ型胶原酶、PBS溶液、胎牛血清、鸡胚提取物、青霉素和链霉素混合液(青霉素含量10kU/mL、链霉素含量10mg/mL)。上述组分为试剂盒中的主要试剂，不包括细胞过滤筛。本专利技术试剂盒制成成品时，还可添加100目和400目细胞过滤筛各一个。该试剂盒储存条件：细胞筛置于室温即可，DMEM培养基和PBS溶液置于4℃冰箱中，其余试剂均-20℃冷冻保存。使用前应将试剂盒内的溶液放置在37℃水浴锅中预热10min。所述鸡胚提取物按如下方法制备得到：(1)种蛋孵化：选取新鲜受精种蛋，置于37℃全自动恒温孵化箱内进行孵化；(2)蛋壳消毒：孵育至10日龄取出种蛋，用酒精消毒蛋壳表面，气室端向上置于消毒过的蛋托上；(3)取鸡胚：去除气室端蛋壳，拨开尿囊膜，用镊子夹取鸡胚置于平皿中；(4)鸡胚处理：去除胚眼、喙、气囊、膜囊、尿囊膜，用无菌PBS充分冲洗鸡胚3次；(5)鸡胚研磨：将处理好的鸡胚置于无菌玻璃皿中充分剪碎后置于离心管中，用全自动冷冻组织研磨仪充分研磨至匀浆状；(6)浸出：在离心管中加入等量Hanks液，吹打均匀，封口膜密封后置于37℃恒温培养箱中1小时；(7)超声破碎：将密封的离心管取出后，利用非接触式超声波粉碎机进行破碎；(8)反复冻融：将离心管投入液氮中彻底冷冻后取出，室温放置至彻底溶解，如此反复冻融3次；(9)离心：冷冻离心机中4℃、4000r/min离心30分钟，吸取上清液，收集于小瓶中；(10)过滤：将收集的上清液依次用0.44μm和0.22μm滤膜过滤后，即得所述鸡胚提取物，置于-20℃冰箱中保存备用。具体为，所述试剂盒主要包括以下试剂：DMEM培养基500mL、0.25％胰酶50mL、0.2％Ⅰ型胶原酶50mL、PBS溶液500mL、胎牛血清100mL、鸡胚提取物5mL、青霉素和链霉素混合液10mL。本专利技术还涉及所述试剂盒在鸡原代成肌细胞体外培养中的应用。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术试剂盒包含了鸡原代成肌细胞培养所需的所有试剂，可特异性培养鸡原代成肌细胞。试剂盒中鸡胚提取物为本产品特有的细胞培养营养物质，结合DMEM培养基和胎牛血清，可最大限度的提供鸡成肌细胞生长所需的各类营养。所培养的鸡原代成肌细胞形态饱满、均一，繁殖活力强。使用本试剂盒培养的鸡原代成肌细胞经传代后，可用于细胞转染、免疫荧光、提取鸡成肌细胞RNA和蛋白质等各种细胞及分子实验。(四)附图说明图1为细胞贴壁培养48h图片(10×)；图2为细胞生长曲线。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：鸡胚提取物提取方法：(1)种蛋孵化：选取新鲜受精种蛋，置于37℃全自动恒温孵化箱内；(2)表面消毒：孵育至10日龄取出种蛋，酒精消毒蛋壳表面，气室端向上置于消毒过的蛋托上；(3)取鸡胚：去除气室端蛋壳，拨开尿囊膜，用镊子夹取鸡胚置于平皿中；(4)鸡胚处理：去除胚眼、喙、气囊、膜囊、尿囊膜等，用无菌PBS充分冲洗鸡胚3次；(5)鸡胚研磨：将处理好的鸡胚置于无菌玻璃皿中充分剪碎后置于离心管中，用全自动冷冻组织研磨仪充分研磨至匀浆状；(6)浸出：在离心管中加入等量Hanks液，吹打均匀，封口膜密封后置于37℃恒温培养箱中1小时；(7)超声破碎：将密封的离心管取出后，利用非接触式超声波粉碎机进行破碎；(8)反复冻融：将离心管投入液氮中彻底冷冻后取出，室温放置至彻底溶解，如此反复冻融3次；(9)离心：冷冻离心机中4℃、4000r/min离心30分钟，吸取上清液，收集于小瓶中；(10)过滤：将收集的上清液依次用0.44μm和0.22μm滤膜过滤后，即得所述鸡胚提取物，置于-80℃冰箱中保存备用。注：所有过程均遵循无菌操作规范。实施例2：一、操作步骤：使用前将试剂盒内的溶液放置在37℃水浴锅中预热10min，先配制完全培养基(每100mLDMEM培养基中加入胎牛血清20mL、实施例1鸡胚提取物1mL、青霉素和链霉素混合液1mL(青霉素和链霉素混合液中青霉素含量10kU/mL、链霉素含量10mg/mL)和含双抗的PBS溶液(每100mLPBS溶液中加入1mL青霉素和链霉素混合液)。1.取10胚龄鸡受精种蛋，碘酒擦拭蛋壳表面消毒后，置于超净台；75％酒精棉消毒胚蛋气室端，眼科剪刀小心呈环状剪开气室端蛋壳，眼科镊撕开蛋膜。长镊夹住鸡胚颈部，取出鸡胚置于含双抗的PBS溶液的培养皿中清洗掉2～3次。2.眼科剪取鸡胚腿肌，置于新的培养皿中，使用PBS冲洗鸡胚2～3次，洗去残血及杂质。3.将洗净后的腿肌置于新培养皿中，充分剪碎至约1mm3，移入离心管中。4.加入组织块2倍体积的0.2％Ⅰ型胶原酶在37℃恒温摇床中消化40min；再加入与胶原酶相同体积的0.25％胰酶消化10min，加入等体积含胎牛血清的完全培养基轻轻吹打至悬液状，终止消化。5.将细胞悬液依次经过100目和400目细胞过滤筛。6.所得过滤液1000r/min离心5min，弃去上清液，用3mL新鲜完全培养基重悬细胞沉淀。7.将细胞接种至培养板或培养瓶中，完全培养基加至所需体积，置于37℃、5％CO2培养箱中。二、注意事项：1.所有过程均遵循无菌操作规范。2.所用培养板或培养瓶底铺有鼠尾胶原培养效果更佳。3.若有少量成纤维细胞，可用差数贴壁法分离。三、实验结果：1.细胞形态观察：如图1所示，48h所培养的原代鸡成肌细胞形态饱满，贴壁后细胞呈梭形或三角形。2.细胞生长曲线测定采用第2代鸡成肌细胞绘制细胞生长曲线，在96孔板中每孔加入约0.2×104个细胞，设3个重复孔，连续培养9天，每天定点加入10μLCCK-8溶液后继续在培养箱内孵育150min，以无细胞只加完全培养液的孔为空白对照，酶标仪450nm测定吸光度进行检测。如图2所示，细胞生长曲线结果表明，鸡成肌细胞在培养后1天开始缓慢增殖，2天时细胞大量增殖，细胞数量显著增多，培养至第7天时细胞生长速度明显减缓，到第8天时细胞生长进去平台期。所培养的鸡成肌细胞生长曲线呈明显的“S”形，符合细胞生长规律。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒，主要包括以下试剂：DMEM培养基、0.25％胰酶、0.2％Ⅰ型胶原酶、PBS溶液、胎牛血清、鸡胚提取物、青霉素和链霉素混合液。

【技术特征摘要】
1.一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒，主要包括以下试剂：DMEM培养基、0.25％胰酶、0.2％Ⅰ型胶原酶、PBS溶液、胎牛血清、鸡胚提取物、青霉素和链霉素混合液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述鸡胚提取物按如下方法制备获得：(1)种蛋孵化：选取鸡新鲜种蛋，置于37℃全自动恒温孵化箱内进行孵化；(2)蛋壳消毒：孵育至10日龄取出种蛋，用酒精消毒蛋壳表面，气室端向上置于消毒过的蛋托上；(3)取鸡胚：去除气室端蛋壳，拨开尿囊膜，用镊子夹取鸡胚置于平皿中；(4)鸡胚处理：去除胚眼、喙、气囊、膜囊、尿囊膜，用无菌PBS充分冲洗鸡胚3次；(5)鸡胚研磨：将处理好的鸡胚置于无菌玻璃皿中充分剪碎后置于离心管中，用全自动冷冻组织研磨仪充分研磨至匀浆状；(6)浸出：在离心管中加入等量Hanks液，吹打均匀，封口...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹兆正，毛海光，曹海月，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33