一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术公开的同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌，通过对受体菌进行如下改造得到：敲除受体菌的xylB基因、glcD基因、aceB基因、glcB基因、gcl基因、aceEF基因；增加受体菌中dte基因、fucK基因、fucA基因、aldA基因、ackA基因、pta基因编码蛋白质的含量。本发明专利技术获得的工程菌株，有利于简化PLGA的合成步骤，同时生产乙醇酸和乳酸两种单体，并且重组菌在摇瓶培养中的乙醇酸和乳酸的产量能达到理想水平，具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于生物技术、基因工程和发酵工程领域，涉及一种利用木糖、葡萄糖和乙酸三种底物进行发酵同时生产乙醇酸和乳酸两种产物的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
乙醇酸又称羟基乙酸，是最简单的α-羟基羧酸。作为重要的化工产品和有机合成中间体，乙醇酸在化工、医药、纺织和冶金等多个领域有广泛应用。例如，2％乙醇酸和1％甲酸的混合酸是一种高效低成本的清洗剂，可用于锅炉、管道、冷凝器和热交换器等的清洗；乙醇酸分子小，能有效渗透毛孔，解决皮肤老化、皱纹和暗疮等问题，常用作化妆品添加剂；纺织行业中常用乙醇酸作为染整羊毛纤维及纤维素织品的交联耦合剂；另外，乙醇酸还可用作杀菌剂、粘接剂、石油破乳剂、焊接剂以及化学助剂等。2011年，乙醇酸市场利润为9330万美元，预计2018年可能超过2亿美元。在自然界中，乙醇酸存在于甘蔗、甜菜以及未成熟的葡萄汁中，含量低且与多种物质共存，分离纯化较为困难。工业上普遍采用化学合成的方法获得乙醇酸，例如氯乙酸法、甲醛羰基化法和氰化法等。化学法生产乙醇酸虽然工艺较为成熟，但是普遍存在原料毒性大(甲醛、一氧化碳和氰化物等)、生产条件苛刻(强酸或强碱、高温高压等)、反应设备要求高、分离纯化复杂和环境污染等问题，不符合当前低碳环保的可持续发展理念，迫切需要开发新的绿色合成工艺。通过微生物发酵的方法利用可再生生物质资源来获得乙醇酸，能够避免化学法合成的弊端，符合绿色化工发展的要求。乳酸又名2-羟基丙酸，是比乙醇酸多一个碳原子的羟基羧酸。乳酸在自然界中普遍存在，根据其旋光性不同，有D-乳酸、L-乳酸和D,L-乳酸三种形式，其中L-乳酸对人体无毒害作用，广泛应用于食品、饮料、医药和化妆品等领域。此外，乳酸能够通过化学法聚合为聚乳酸，可作为生物可降解材料使用。2015年，全球乳酸产量约为50万吨，用于食品和饮料领域的占比接近50％，用于聚乳酸领域的占比超过30％。乳酸的制备方法有化学法、酶法和微生物发酵法。微生物发酵法具有生产成本低、原料来源广、产物光学纯度高等优点，是目前工业上生产乳酸的主要方法。发酵使用的菌种有乳杆菌Lactobacillus、芽孢杆菌Bacillus、米根霉Rhizopus、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae和大肠杆菌Escherichiacoli等，主要生产企业有荷兰Corbion-Purac、美国Cargill与ArcherDanielsMidland、比利时Galactic和日本武藏野等。利用非粮廉价原料例如纤维素、木薯、糖蜜和菊芋等发酵生产乳酸已有若干研究，但是玉米淀粉仍是目前大规模使用的原料，由此导致乳酸价格偏高，限制了其广泛应用。乳酸和乙醇酸可以通过化学法共聚合成聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)。PLGA具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作为生物医用材料使用。与聚乳酸(polylacticacid，PLA)或者聚乙醇酸(polyglycolicacid，PGA)相比，PLGA共聚物具有更加多样的材料学性能。PLGA是少数几种美国食品药品管理局(FDA)批准的生物可降解医用材料之一，常用作手术缝合线、药物缓释载体、骨科固定及组织修复材料等。在药物缓释领域，PLGA是近年来文献报导最多的微球包覆材料之一，涉及的药物包括紫杉醇、阿霉素等小分子，重组生长激素、胰岛素等多肽和蛋白质大分子，以及多种疫苗等。PLGA的合成需要分别制备乳酸和乙醇酸单体，再进行化学法聚合。乳酸主要通过发酵法生产，乙醇酸主要通过氯乙酸法、甲醛羰基化法和氰化法等化学法生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何利用木糖、葡萄糖和乙酸同时生产出乙醇酸和乳酸。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了重组菌的构建方法，所述方法包括对受体菌进行下述A1-A12的改造，得到所述重组菌；A1、敲除所述受体菌的木酮糖激酶基因(xylB基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：948133)或抑制所述xylB基因的表达或抑制所述xylB基因编码的蛋白质的活性；A2、敲除所述受体菌的乙醇酸氧化酶基因(glcD基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：947353)或抑制所述glcD基因的表达或抑制所述glcD基因编码的蛋白质的活性；A3、敲除所述受体菌的苹果酸合酶A基因(aceB基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：948512)或抑制所述aceB基因的表达或抑制所述aceB基因编码的蛋白质的活性；A4、敲除所述受体菌的苹果酸合酶G基因(glcB，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：948857)基因或抑制所述glcB基因的表达或抑制所述glcB基因编码的蛋白质的活性；A5、敲除所述受体菌的羟丙二酸半醛合酶基因(gcl基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：945394)或抑制所述gcl基因的表达或抑制所述gcl基因编码的蛋白质的活性；A6、敲除所述受体菌的丙酮酸脱氢酶基因(aceE基因和aceF基因，记为aceEF基因；aceE基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：944834；aceF基因，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：944794)或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；A7、增加所述受体菌中磷酸戊糖异构酶基因(dte基因)编码蛋白质的含量或增强所述dte基因编码蛋白质的活性；A8、增加所述受体菌中墨角藻糖激酶基因(fucK基因)编码蛋白质的含量或增强所述fucK基因编码蛋白质的活性；A9、增加所述受体菌中墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因(fucA基因)编码蛋白质的含量或增强所述fucA基因编码蛋白质的活性；A10、增加所述受体菌中醛脱氢酶基因(aldA基因)编码蛋白质的含量或增强所述aldA基因编码蛋白质的活性；A11、增加所述受体菌中乙酸激酶基因(ackA基因)编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性；A12、增加所述受体菌中磷酸转乙酰酶基因(pta基因)编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性；所述受体菌为含有所述xylB基因、所述glcD基因、所述aceB基因、所述glcB基因、所述gcl基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。上述方法中，所述受体菌为1)或2)：1)大肠杆菌；2)大肠杆菌MG1655。上述方法中，所述dte基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：a1)序列表中序列12所示的蛋白质；a2)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述fucK基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：b1)序列表中序列13所示的蛋白质；b2)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述fucA基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：c1)序列表中序列14所示的蛋白质；c2)将序列表中序列14的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组菌的构建方法，包括对受体菌进行下述A1‑A12的改造，得到所述重组菌；A1、敲除所述受体菌的xylB基因或抑制所述xylB基因的表达或抑制所述xylB基因编码的蛋白质的活性；A2、敲除所述受体菌的glcD基因或抑制所述glcD基因的表达或抑制所述glcD基因编码的蛋白质的活性；A3、敲除所述受体菌的aceB基因或抑制所述aceB基因的表达或抑制所述aceB基因编码的蛋白质的活性；A4、敲除所述受体菌的glcB基因或抑制所述glcB基因的表达或抑制所述glcB基因编码的蛋白质的活性；A5、敲除所述受体菌的gcl基因或抑制所述gcl基因的表达或抑制所述gcl基因编码的蛋白质的活性；A6、敲除所述受体菌的aceEF基因或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；A7、增加所述受体菌中dte基因编码蛋白质的含量或增强所述dte基因编码蛋白质的活性；A8、增加所述受体菌中fucK基因编码蛋白质的含量或增强所述fucK基因编码蛋白质的活性；A9、增加所述受体菌中fucA基因编码蛋白质的含量或增强所述fucA基因编码蛋白质的活性；A10、增加所述受体菌中aldA基因编码蛋白质的含量或增强所述aldA基因编码蛋白质的活性；A11、增加所述受体菌中ackA基因编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性；A12、增加所述受体菌中pta基因编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性；所述受体菌为含有所述xylB基因、所述glcD基因、所述aceB基因、所述glcB基因、所述gcl基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。...

【技术特征摘要】
1.重组菌的构建方法，包括对受体菌进行下述A1-A12的改造，得到所述重组菌；A1、敲除所述受体菌的xylB基因或抑制所述xylB基因的表达或抑制所述xylB基因编码的蛋白质的活性；A2、敲除所述受体菌的glcD基因或抑制所述glcD基因的表达或抑制所述glcD基因编码的蛋白质的活性；A3、敲除所述受体菌的aceB基因或抑制所述aceB基因的表达或抑制所述aceB基因编码的蛋白质的活性；A4、敲除所述受体菌的glcB基因或抑制所述glcB基因的表达或抑制所述glcB基因编码的蛋白质的活性；A5、敲除所述受体菌的gcl基因或抑制所述gcl基因的表达或抑制所述gcl基因编码的蛋白质的活性；A6、敲除所述受体菌的aceEF基因或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；A7、增加所述受体菌中dte基因编码蛋白质的含量或增强所述dte基因编码蛋白质的活性；A8、增加所述受体菌中fucK基因编码蛋白质的含量或增强所述fucK基因编码蛋白质的活性；A9、增加所述受体菌中fucA基因编码蛋白质的含量或增强所述fucA基因编码蛋白质的活性；A10、增加所述受体菌中aldA基因编码蛋白质的含量或增强所述aldA基因编码蛋白质的活性；A11、增加所述受体菌中ackA基因编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性；A12、增加所述受体菌中pta基因编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性；所述受体菌为含有所述xylB基因、所述glcD基因、所述aceB基因、所述glcB基因、所述gcl基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌为1)或2)：1)大肠杆菌；2)大肠杆菌MG1655。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述dte基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：a1)序列表中序列12所示的蛋白质；a2)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述fucK基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：b1)序列表中序列13所示的蛋白质；b2)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述fucA基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：c1)序列表中序列14所示的蛋白质；c2)将序列表中序列14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述aldA基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质：d1)序列表中序列15所示的蛋白质；d2)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述ackA基因编码蛋白质为下述e1)或e2)的蛋白质：e1)序列表中序列16所示的蛋白质；e2)将序列表中序列16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述pta基因编码蛋白质为下述f1)或f2)的蛋白质：f1)序列表中序列17所示的蛋白质；f2)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：A1通过向所述受体菌中导入含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述dte基因的dte基因表达盒实现；和/或，A8通过向所述受体菌中导入含有所述fucK基因的fucK基因表达盒实现；和/或，A9通过向所述受体菌中导入含有所述fucA基因的fucA基因表达盒实现；和/或，A10通过向所述受体菌中导入含有所述aldA基因的aldA基...

【专利技术属性】
技术研发人员：李正军，李微，魏圣楠，朱秋雨，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11