一种高产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高产L‑亮氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程领域。本发明专利技术应用基因工程方法，替换谷氨酸棒杆菌中NADP依赖型支链氨基酸转氨酶为来源于球形芽孢杆菌NAD依赖型亮氨酸脱氢酶LeuDH，构建新的、高效的L‑亮氨酸合成途径并解决谷氨酸棒杆菌L‑亮氨酸产生菌中NADH积累量过多，NADPH供应量不足的缺点，增强重组菌株中L‑亮氨酸合成能力并提高菌株积累NADPH的能力。重组菌经摇瓶发酵实验，L‑亮氨酸积累量达16.7g·L

A Recombinant Corynebacterium glutamicum with High L-Leucine Production and Its Construction Method

The invention discloses a Corynebacterium glutamicum recombinant strain with high L leucine production and a construction method thereof, which belongs to the field of genetic engineering. The invention applies genetic engineering method to replace NADP-dependent branched-chain amino acid transaminase from Corynebacterium glutamicum as NAD-dependent leucine dehydrogenase LeuDH from Bacillus globosa, constructs a new and efficient synthesis pathway of L-leucine, solves the shortcomings of excessive accumulation of NADH and insufficient supply of NADPH in Corynebacterium glutamicum L-leucine producing bacteria, and enhances L-leucine in recombinant strains. The ability of leucine synthesis and NADPH accumulation were enhanced. After shaking flask fermentation, the accumulation of L leucine reached 16.7g.L.

【技术实现步骤摘要】
一种高产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法
本专利技术涉及一种高产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程领域。
技术介绍
L-亮氨酸，又名白氨酸，其化学名称为α-氨基-γ-甲基戊酸，α-氨基异己酸，与L-缬氨酸、L-异亮氨酸同具有甲基侧链分支结构而统称为支链氨基酸。由于人和哺乳动物都不能自身合成这三种氨基酸而必需依赖外源供给，故三者也都同属于必需氨基酸。L-亮氨酸具有多种生理功能，广泛应用于食品添加剂，制药行业，化妆品行业和动物饲料添加剂行业。同时，也广泛用于临床作为复合氨基酸静脉注射液。因此，选育具有自主知识产权的高L-亮氨酸合成、低副产物积累的生产菌株，实现企业可持续发展具有重要意义。L-亮氨酸的生产方法主要有提取法，化学合成法，添加前体物质发酵法，直接发酵法等。微生物发酵法反应条件温和，环境友好，产品质量稳定，是L-亮氨酸的主要生产方法。L-亮氨酸产生菌多为随机突变获得，通常用谷氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌和黄色短杆菌作为宿主菌，诱变处理，选出营养缺陷型或者氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节过程中反馈阻遏和抑制，达到过量积累L-亮氨酸的目的。然而，化学诱变筛选氨基酸产生菌有很多问题，如产生不必要的突变，生成副产物，菌体生长缓慢等。亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase，LeuDH)是一种NAD依赖型的氧化还原酶，它可逆的催化L-亮氨酸和其他支链氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物，可用于测定支链脂肪酸及其酮酸类似物，同时可催化酮酸还原制备L-亮氨酸及L-叔亮氨酸等氨基酸。该酶在芽孢杆菌中有较高的表达水平，主要参与支链L-氨基酸的体内代谢。Sanwal和Zink于1961年首先在芽孢杆菌属的Bacilluscereus发现并纯化了亮氨酸脱氢酶，此后Bacillussphaerius、Bacillusstearothermophlius、Clostridiumthermoaceticum等产LeuDH菌株相继被筛选出来。该酶分子量约40kDa，由六个相同亚基组成，酶反应时需要NADH为辅因子。然而，作为主要的支链氨基酸生产菌株谷氨酸棒杆菌却不存在该酶。有文献指出在谷氨酸棒杆菌中异源表达LeuDH，能够改变L-缬氨酸合成途径中辅因子NADPH的供应，从而有利于L-缬氨酸合成。因此，筛选得到以NADH为辅因子的亮氨酸脱氢酶是改善L-亮氨酸产生菌胞内辅因子不平衡的关键。代谢工程提供了一个有效的可替代传统诱变的育种方法。但是现有的通过代谢途径改造的L-亮氨酸生产菌依然存在产量低，副产物含量高的问题。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术首次将来源于球状芽孢杆菌(B.sphaericus)中以NADH为辅因子的LeuDH引入到谷氨酸棒杆菌的L-亮氨酸产生菌中，提高了重组菌株中L-亮氨酸的产量，并且有效降低副产物含量。本专利技术的第一个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌重组菌，所述重组菌是在生产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌中异源表达了芽孢杆菌属来源的亮氨酸脱氢酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述生产L-亮氨酸产生菌包括谷氨酸棒杆菌及其亚种，谷氨酸棒杆菌ATCC13032，谷氨酸棒杆菌ATCC14067，谷氨酸棒杆菌ATCC13869，钝齿棒杆菌，其中本专利技术涉及到的L-亮氨酸产生菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株或其经过诱变筛选得到的C.glutamicumXQ-9，且C.glutamicumXQ-9是蛋氨酸和异亮氨酸缺陷型，具有α-噻唑丙氨酸，α-氨基丁酸，磺胺胍和亮氨酸氧肟酸盐抗性。在本专利技术的一种实施方式中，所述芽孢杆菌属为球形芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶为以下任一：(1)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示(核苷酸序列如SEQIDNO.2)；(2)与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有亮氨酸脱氢酶活性。在本专利技术的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶的插入位置为支链氨基酸转氨酶的编码基因ilvE基因编码序列中间，实现部分缺失ilvE编码基因同时表达亮氨酸脱氢酶。在本专利技术的一种实施方式中，是以pK18mobsacB作为表达载体。本专利技术的第二个目的是提供一种所述重组菌的构建方法，具体是：(1)重组表达载体pDXW-8-leuDH的构建将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的leuDH片段与经相同限制性内切酶酶切后的C.glutamicum-E.coli穿梭表达质粒pDXW-8(已在CN101693901A中公开)相连构建重组质粒pDXW-8-leuDH；(2)表达框Ptac-leuDH-rrnBT1T2的获取以pDXW-8-leuDH为模板，进行PCR，获得含有强启动子Ptac和终止子rrnBT1T2的Ptac-leuDH-rrnBT1T2表达框；所述的强启动子Ptac和终止子rrnBT1T2的核苷酸序列分别为序列表中SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。(3)整合型载体pK18mobsacB-△ilvE::leuDH的构建以C.glutamicumATCC13032或C.glutamicumXQ-9基因组为模板设计引物，进行PCR，获得分别在3’端和5’端有相同限制性内切酶的PCR产物，将以上述PCR产物分别与线性化pK18mobsacB自杀型载体相连构建重组质粒pK18mobsacB-△ilvE；随后将将纯化后的PCR产物Ptac-leuDH-rrnBT1T2与pK18mobsacB-△ilvE连接，获得重组质粒pK18mobsacB-△ilvE::leuDH；所述△ilvE片段由支链氨基酸转氨酶的左同源臂和右同源臂拼接而成，其核苷酸序列分别为序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。(4)重组菌株C.glutamicumXQ-△ilvE::leuDH或C.glutamicumATCC13032-△ilvE::leuDH的构建将质粒pK18mobsacB-△ilvE::leuDH电击转化C.glutamicumXQ-9或者谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC13032，筛选得到重组菌C.glutamicumXQ-9-△ilvE::leuDH或者谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC13032-△ilvE::leuDH。在本专利技术的一种实施方式中，所述支链氨基酸转氨酶基因序列与C.glutamiucmATCC13032来源的ilvE基因序列一致(氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，核苷酸序列如SEQIDNO:8所示)。本专利技术的第三个目的是提供所述重组菌发酵生产L-亮氨酸的方法，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，28-29℃，80-120r·min-1培养10-14h；以5-15％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，28-30℃，80-120r·min-1培养60-80h。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子培养基(g·L-1)：葡萄糖30-35，玉米浆30-40，酵母膏5-15，(NH4)2SO45-15，KH2PO42-4，MgSO4·7H2O0.5-1.5，MnSO4·4H2O0.05-0.15，柠檬酸钠5-15，尿素2-10，L-蛋氨酸0.5-1.5，硫胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是在生产L‑亮氨酸的谷氨酸棒杆菌中异源表达了芽孢杆菌属来源的亮氨酸脱氢酶。

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是在生产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌中异源表达了芽孢杆菌属来源的亮氨酸脱氢酶。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述生产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌为蛋氨酸和异亮氨酸缺陷型，同时具有α-噻唑丙氨酸和α-氨基丁酸抗性的谷氨酸棒杆菌。3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述芽孢杆菌属为球形芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶为以下任一：(1)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)与SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有80％以上同源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟国，钱和，王颖妤，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32