表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器及应用，该方法首先在埃洛石纳米管上修饰磁性材料四氧化三铁，然后在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3‑氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺，使修饰后的磁性埃洛石纳米管内、外壁都带正电，最后依次在其管内通过物理吸附、外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶，即得到酶反应器。本发明专利技术基于内外壁同时固定提高了氯过氧化物酶的固载量，所得酶反应器回收简单便捷，重复使用9次后能保持92.20％催化活性，在70～80℃的热稳定性较游离酶好，在DMF、甲醇、乙腈等有机溶剂中耐受性好，用于降解利福昔明的降解效率高，当利福昔明的含量为50μg/mL以内时，降解效率均可达到90％以上。

Simultaneous immobilization of chloroperoxidase on the inner and outer walls of surface-modified magnetic halloysite nanotubes and its application

The invention discloses a surface-modified magnetic halloysite nanotube inner and outer walls simultaneously immobilizing chloroperoxidase reactor and its application. The method first modifies the magnetic material Fe3O4 on the halloysite nanotube, then modifies the surface of the magnetic halloysite nanotube successively with 3 aminopropyl triethoxysilane and polyvinylimide, so as to make the modified magnetic halloysite nanotube inner and outer walls. All of them are positively charged. Finally, the enzymatic reactor is obtained by physical adsorption in the tube and covalent binding in the outer wall. Based on the simultaneous immobilization of the inner and outer walls, the immobilization capacity of chloroperoxidase is increased. The obtained enzyme reactor is simple and convenient to recover, can maintain 92.20% catalytic activity after nine reuses, has better thermal stability at 70-80 C than free enzyme, has good tolerance in DMF, methanol, acetonitrile and other organic solvents, and has high degradation efficiency for rifaximin degradation, when rifaximin content is 50 ug/ Within mL, the degradation efficiency can reach more than 90%.

【技术实现步骤摘要】
表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器及应用
本专利技术属于酶的固定化
，具体涉及一种氨基修饰的外部改性的磁性埃洛石纳米管固定氯过氧化物酶反应器及应用。
技术介绍
生物酶是由活细胞产生的具有催化作用的有机物，大部分为蛋白质，它是一种无毒、对环境友好的生物催化剂。生物酶催化效率非常高，具有高度特异性，一种酶只能催化一种或者一类化学反应，反应条件温和。但是游离酶在高温、强酸强碱、有机溶剂等环境容易失活，采用固定化酶的方式可以有效提高酶对温度、酸碱性、有机溶剂的耐受性。对固定化载体用磁性物质修饰，使酶的回收更加简单，降低了使用成本。氯过氧化物酶(CPO)是从海洋真菌Caldariomycesfumago中分离出来的一种血红素过氧化物酶(42kDa)，兼具血红素过氧化物酶、过氧化氢酶以及细胞色素P-450等多种酶的催化特征，目前被认为是过氧化物酶家族中应用最广泛的酶。CPO可以催化多种有机反应，如：卤化反应、过氧化反应、羟基化反应、环氧化反应、磺化氧化反应，所以CPO具有很大的应用潜力。埃洛石纳米管(Halloysitenanotubes，简称HNTs)的化学通式为Al2Si2O5(OH)4·nH2O，呈中空管状结构，管壁是由SiO4四面体层与AlO6八面体层堆叠卷曲而成，内层主要是Al-O带正电，而外层主要是Si-O带负电。埃洛石纳米管价格低廉，具有良好的生物相容性，可被用作生物酶固定化的固相载体。但埃洛石纳米管的这种内腔带正电、外壁带负电，内外表面组成成分不同的管状结构在选择性修饰上具有明显优势，却不利于酶的固载量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有埃洛石纳米管固定化酶技术中存在的酶固载量不高的问题，利用埃洛石纳米管表面组成成分不同的优势先对其外表面进行表面修饰，既引入磁性材料提高其重复使用性，同时又引入倍增的氨基提高固定化效果，还可以改变埃洛石纳米管的表面电性，使得其内外壁同时带有正电荷；在此基础上通过减压真空操作及改变pH调整CPO所带电荷，从而提供一种磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器。并为该固定化酶反应器提供一种新的应用。解决上述技术问题所采用的固定化酶反应器是：首先在埃洛石纳米管上修饰磁性材料四氧化三铁，然后在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺，使修饰后的磁性埃洛石纳米管内、外壁都带正电，最后依次在其管内通过物理吸附、外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶，即得到酶反应器。上述在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺的方法为：将磁性埃洛石纳米管均匀分散于无水乙醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液，常温搅拌20～30h，通过强磁铁收集产物，用无水乙醇离心洗涤固体至上清液呈中性，冷冻干燥10～15h，再将干燥产物均匀分散于甲醇中，加入聚乙烯亚胺，常温搅拌20～30h，再加入质量分数为0.3％～0.8％的戊二醛水溶液，搅拌反应2～4h，通过强磁铁收集产物，用去离子水和无水乙醇离心洗涤至上清液透明呈中性，冷冻干燥12h，得到管内、外壁都带正电的表面改性磁性埃洛石纳米管。上述在表面改性磁性埃洛石纳米管的管内通过物理吸附固定氯过氧化物酶的方法为：将表面改性磁性埃洛石纳米管加入pH＝3.5～5的磷酸缓冲溶液，常温超声处理25～40min，然后加入游离氯过氧化物酶溶液，超声处理4～6min后，最后循环抽真空、放气至少3次，每次真空条件下常温保持20～40min。其中所述表面改性磁性埃洛石纳米管与游离氯过氧化物酶溶液的质量-体积比优选为1g：10～15mL，所述游离氯过氧化物酶溶液中氯过氧化物酶的浓度为22～28μmol·L-1。上述在表面改性磁性埃洛石纳米管的外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶的方法为：在最后一次抽真空、放气完后，将反应液在15～20℃、100～200rpm下振荡10～15h，通过强磁铁收集产物，并用pH＝3.5～5的磷酸缓冲溶液洗涤，将所得产物真空干燥，得到表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器。其中真空干燥的温度为20～30℃。本专利技术表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器在降解利福昔明中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术将磁性埃洛石纳米管用APTES和PEI这两种物质进行修饰，增加了埃洛石纳米管表面的氨基数目，增大了酶与载体的结合机会，而且这些修饰可使埃洛石纳米管外壁变为正电，通过减压真空操作及改变溶液pH从而调整CPO所带电荷，再分别通过物理和共价结合的方式固定在纳米管内管外壁，提高了酶的固载量。同时，酶反应器可采用磁性分离方式，可以简化回收步骤，节省时间，且酶分子从载体上脱落的可能性减小，在移去上层反应液时材料的损失也会更小，降低了酶的成本，具有客观的经济效益。本专利技术利用管内、外壁都带正电的表面改性磁性埃洛石纳米管作为载体固定CPO，既能保持酶的催化活性又能克服游离酶的一些缺点，使酶分子结构的稳定性及操作稳定性提高，而且容易从反应环境中分离出来，提高重复使用次数，重复使用9次后能保持92.20％催化活性，使用12次后催化活性为41.60％；在70℃放置1h后能保持99％左右的催化活性，80℃放置1h后能保持78.08％活性，较游离酶热稳定性好；在10％DMF、甲醇、乙腈等有机溶剂中的催化活性分别为97.44％、99.46％、98.57％；用于降解利福昔明的降解效率高，当利福昔明的含量为50μg/mL以内时，降解效率均可达到90％以上。附图说明图1是实施例1制备的表面改性磁性埃洛石纳米管的磁性分离效果图。图2是温度对CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI催化活性的影响图。图3是CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI在缓冲溶液中的重复使用性图。图4是DMF对CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI催化活性的影响图。图5是甲醇对CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI催化活性的影响图。图6是乙腈对CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI催化活性的影响图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于这些实施例。实施例11、制备磁性埃洛石纳米管称取5g埃洛石纳米管置于600mL烧杯中，加入400mL去离子水，超声处理15min，继续加入3.8gFeCl3·6H2O和3gFeSO4·7H2O，完全溶解后转移至三口烧瓶中，加入3～5滴浓盐酸，通入N2，120℃油浴3h后，停止加热，冷却至50℃。再逐滴加入4moL·L-1NaOH水溶液，调节pH值为9～10，在50℃下继续搅拌2.5h，得到黑色固体并用强磁铁收集，用去离子水和无水乙醇交替离心洗涤至上清液无色，50℃真空干燥6h，得到磁性埃洛石纳米管。2、制备表面改性磁性埃洛石纳米管称取2g磁性埃洛石纳米管置于250mL烧杯中，加入100mL无水乙醇，500rpm转速搅拌均匀；将10mLAPTES和10mL去离子水搅拌充分混匀后，逐滴加入烧杯中，继续搅拌24h，得到黑褐色浊液。停止反应，通过强磁铁收集产物，用无水乙醇离心洗涤固体至上清液呈中性，冷冻干燥12h。将1g干燥产物均匀分散在99mL甲醇中，加入1mLPEI，80本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：首先在埃洛石纳米管上修饰磁性材料四氧化三铁，然后在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3‑氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺，使修饰后的磁性埃洛石纳米管内、外壁都带正电，最后依次在其管内通过物理吸附、外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶，即得到酶反应器。

【技术特征摘要】
1.一种表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：首先在埃洛石纳米管上修饰磁性材料四氧化三铁，然后在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺，使修饰后的磁性埃洛石纳米管内、外壁都带正电，最后依次在其管内通过物理吸附、外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶，即得到酶反应器。2.根据权利要求1所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺的方法为：将磁性埃洛石纳米管均匀分散于无水乙醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液，常温搅拌20～30h，通过强磁铁收集产物，用无水乙醇离心洗涤固体至上清液呈中性，冷冻干燥10～15h，再将干燥产物均匀分散于甲醇中，加入聚乙烯亚胺，常温搅拌20～30h，再加入质量分数为0.3％～0.8％的戊二醛水溶液，搅拌反应2～4h，通过强磁铁收集产物，用去离子水和无水乙醇离心洗涤至上清液透明呈中性，冷冻干燥12h，得到管内、外壁都带正电的表面改性磁性埃洛石纳米管。3.根据权利要求2所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：在表面改性磁性埃洛石纳米管的管内通过物理吸附固定氯过氧化物酶的方法为：将表面改性磁性埃洛石纳米管加入pH＝3.5～...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋育澄，陈宝林，胡满成，李淑妮，翟全国，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61