蓝果忍冬SRAP反应体系的建立制造技术

蓝果忍冬SRAP反应体系的建立属于分子生物学领域，SRAP作为一种新型的分子标记，具有操作简单、稳定和高效等特点，广泛应用于不同作物的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析各种研究，与其他PCR技术类似，其扩增结果易受到Tag DNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物等反应因素的影响，因此，进行SRAP体系的优化是获得较好研究结果的先决条件。建立蓝果忍冬SRAP反应体系，能够简单、稳定、高效的获得丰富的多态性DNA，以应用于蓝果忍冬的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析等。

Establishment of SRAP Reaction System of Lonicera edulis

The establishment of SRAP reaction system of Lonicera japonica belongs to the field of molecular biology. As a new molecular marker, SRAP has the characteristics of simple operation, stability and high efficiency. It has been widely used in the study of map construction, gene location and genetic diversity analysis of different crops. Similar to other PCR techniques, its amplification results are vulnerable to Tag DNA polymerase, template DNA, dNTPs, Mg2+, and so on. Therefore, the optimization of SRAP system is a prerequisite for obtaining better results. Establishing SRAP reaction system of Lonicera edulis can obtain abundant polymorphic DNA simply, stably and efficiently, which can be applied to map construction, gene mapping and genetic diversity analysis of Lonicera edulis.

【技术实现步骤摘要】
蓝果忍冬SRAP反应体系的建立
：本专利技术属于分子生物学领域，主要涉及蓝果忍冬SRAP反应体系的建立。
技术介绍
：相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism，SRAP)又叫做基于序列扩增多态性(sequence-baseamplifiedpolymorphism，SBAP)，是由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros博士于2001年提出。该标记技术也是一种基于简单PCR的新的标记系统，它主要是通过独特的引物设计对开放阅读框(ORF)进行扩增，引物由核心序列和3个选择性碱基组成，其中核心序列含非特异性填充序列和特异性序列两部分。SRAP-PCR反应体系使用两个引物，17碱基上游引物和18碱基下游引物。上游引物对外显子进行特异扩增，下游引物对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，由于个体不同及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等，使得扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性标记。SRAP作为一种新型的分子标记，具有操作简单、稳定和高效等特点，广泛应用于不同作物的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析各种研究，与其他PCR技术类似，其扩增结果易受到反应因素的影响，因此，进行SRAP体系的优化是获得较好研究结果的先决条件。dNTPs是PCR的原料，浓度过高，会导致PCR错配，从而出现非特异性扩增，浓度过低，则又影响合成效率，同时dNTPs分子中的磷酸基团能定量地与Mg2+结合，使实际反应中的Mg2+浓度下降，进而影响TagDNA聚合酶的活力。Mg2+是TagDNA聚合酶的激活剂，其浓度不仅影响TagDNA聚合酶的活性，还能与反应液中的dNTPs、模板DNA及引物结合，影响引物与模板的结合效率、模板与PCR产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成。Mg2+是影响PCR扩增最大的因子，因此，选择合适的Mg2+浓度，对PCR反应至关重要。TagDNA聚合酶在PCR中的用量受反应体积、酶的活性及酶的耐热性等因素制约，使用高浓度的Tag酶不仅造成经济上的浪费，而且容易导致非特异性扩增产物积累，电泳呈弥散状；Tag酶用量偏低会使新链合成效率下降，导致扩增产物减少。引物浓度偏低，会使引物与模板的结合率降低，产生的多态性条带减少；随着引物浓度增加，其条带亮度和数目增加，但引物浓度也不能太高，过高的引物浓度会导致非特异性扩增和引物二聚体的形成，从而与靶序列竞争Tag酶和dNTPs，影响靶序列的产量。模板DNA的含量是制约扩增产物得率及特异性的一个重要因素，其完整性对扩增结果具也有很大影响。在银杉研究中发现，DNA模板中残留的微量氯仿、CTAB、异丙醇等往往影响扩增结果，在实验中应尽量去除。一般来说，DNA浓度有一个比较宽的使用范围，一般为20～80ng。
技术实现思路
：本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种蓝果忍冬SRAP反应体系，简单、稳定、高效的获得丰富的多态性DNA，以应用于蓝果忍冬的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析等。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：1、蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)采用单因素试验对体系进行优化，基本反应条件为反应总体积20μl，其中10×PCRbuffer2μl、MgCl22.5mmol/l、dNTPs0.15mmol/l、引物0.1μmol/l、模板DNA20ng、TagDNA聚合酶1.5U，不足部分用双蒸水补足，进行反应。(2)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度TagDNA聚合酶反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的TagDNA聚合酶浓度。(3)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度模板DNA反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的模板DNA浓度。(4)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度dNTPs反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的dNTPs浓度。(5)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度Mg2+反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的Mg2+浓度。(6)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度引物反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的引物浓度。(7)确定蓝果忍冬SRAP最佳反应条件，在多个蓝果忍冬品种样品上检验反应体系的稳定性和可靠性。2、根据权利要求1所述的蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，步骤(1)所述的反应程序为：94℃预变性2-5min；94℃变性1-2min，35℃复性1-2min，72℃延伸1-2min，5个循环；94℃变性1-2min，50℃复性1-2min，72℃延伸1-2s，35个循环；72℃延伸5-10min。3、根据权利要求1所述的蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，步骤(2)所述的TagDNA聚合酶浓度梯度为0.5-2.0U。4、根据权利要求1所述的蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，步骤(3)所述的模板DNA浓度梯度为10-40ng。5、根据权利要求1所述的蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，步骤(4)所述的dNTPs浓度梯度为0.1-0.25mmol/l。6、根据权利要求1所述的蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，步骤(5)所述的Mg2+浓度梯度为1.0-2.5mmol/l。7、根据权利要求1所述的蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，步骤(6)所述的引物浓度梯度为0.1-0.4μmol/l。8、根据权利要求1所述的蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，步骤(7)所述的蓝果忍冬品种包括长白山野生型蓝果忍冬、库页岛蓝果忍冬、大兴安岭野生蓝果忍冬、勃利蓝果忍冬，蓝果忍冬SRAP-PCR的最佳反应体系(20μl)为：2.0μl10×PCRbuffer、1.0-2.0UTagDNA聚合酶、20-40ng模板DNA、0.15-0.25mmol/ldNTPs、1.5-2.5mmol/lMg2+、0.1-0.2μmol/l引物。蓝果忍冬SRAP反应体系的建立属本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)采用单因素试验对体系进行优化，基本反应条件为反应总体积20μl，其中10×PCR buffer 2μl、MgCl2 2.5mmol/l、dNTPs 0.15mmol/l、引物0.1μmol/l、模板DNA 20ng、Tag DNA聚合酶1.5U，不足部分用双蒸水补足，进行反应；(2)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度Tag DNA聚合酶反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的Tag DNA聚合酶浓度；(3)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度模板DNA反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的模板DNA浓度；(4)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度dNTPs反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的dNTPs浓度；(5)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度Mg2+反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的Mg2+浓度；(6)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度引物反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的引物浓度；(7)确定蓝果忍冬SRAP最佳反应条件，在多个蓝果忍冬品种样品上检验反应体系的稳定性和可靠性。...

【技术特征摘要】
1.蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)采用单因素试验对体系进行优化，基本反应条件为反应总体积20μl，其中10×PCRbuffer2μl、MgCl22.5mmol/l、dNTPs0.15mmol/l、引物0.1μmol/l、模板DNA20ng、TagDNA聚合酶1.5U，不足部分用双蒸水补足，进行反应；(2)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度TagDNA聚合酶反应；取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的TagDNA聚合酶浓度；(3)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度模板DNA反应；取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的模板DNA浓度；(4)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度dNTPs反应；取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的dNTPs浓度；(5)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度Mg2+反应；取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，AlphalmagerHP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的Mg2+浓度；(6)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度引物反应；取10μl反应终...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍俊伟，张妍，刘化禹，孙丰，秦栋，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23