一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴妊娠方面的应用制造技术

本发明专利技术提出一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴妊娠方面的应用。该凝集素探针组合为PSA、BS‑I、GSL‑II、DBA和PHA‑E+L的组合；若样本检测结果为PSA、BS‑I和GSL‑II表达上调，且DBA和PHA‑E+L表达下调，则表明相应主体在取样时处于妊娠期。利用本发明专利技术对秦岭川金丝猴妊娠状况进行鉴别，快速、简便、准确，实现成本较低。

【技术实现步骤摘要】
一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴妊娠方面的应用
本专利技术涉及一种鉴别秦岭川金丝猴妊娠的方法。
技术介绍
金丝猴隶属灵长目(Primates)猴科(Cercopithecidae)疣猴亚科(Colobinae)仰鼻猴属(Rhinopithecus)，川金丝猴(Rhinopithecusroxellana)是金丝猴的指名亚种，为中国的特有物种，属国家I级重点保护动物。作为珍稀濒危灵长类，国内外各大动物园都有饲养，通过繁育扩大种群数量，从而将濒危物种就地保护或者迁移到合适的环境中，也为濒危物种野外放归提供可能，提高动物的繁殖能力是其关键所在。但因存在雄猴对怀孕雌猴强行重复交配、抢夺食物，怀孕母猴妊娠早期特征不明显，不能及时对妊娠母猴进行保护，导致人工饲养繁殖过程中流产死产现象严重,极大的影响了繁殖率。川金丝猴的繁殖具有明显的季节性，8‐12月为交配季节，产子期次年3‐5月，孕期6‐7个月，动物妊娠诊断主要分为两类(直接和间接)或三类：一是视觉方法，二是临床方法，三是实验室检查，但因取样过程需要麻醉和反复抓捕动物，会扰乱动物体内激素的正常分泌及循环和新陈代谢过程等、监测周期长、监测指标波动水平大、具有延时性等因素，现阶段也没有能尽早确诊珍稀野生动物怀孕的简单易行的方法。糖基化是最普遍的蛋白质翻译后修饰之一，研究发现约一半以上的哺乳动物蛋白质都发生了糖基化。糖基化作为一种重要的翻译后修饰，可以影响蛋白质的溶解度、折叠、定位及构象的维持，调节蛋白质的功能和降解；还可以介导分子与分子之间、分子与细胞之间、细胞与细胞之间的相互作用，参与几乎所有的生命过程。尿液由于蛋白质成分相对简单，尿液糖蛋白质组学的研究能够有效地去除非糖基化修饰的白蛋白，在尿液中糖基化可以寻找到更多有意义的低丰度糖蛋白，因此在对人的生理变化、疾病诊断当中发挥更大的作用。修饰的改变主要包括两个方面：1)多肽链上糖基化结合位点的改变；2)寡糖链结构的改变。研究发现，在妊娠过程中，血清中糖基化发生了改变，在有糖尿病、肾病等疾病妊娠患者中发生异常变化。不过，目前糖基化改变在妊娠的发展还没有一个完整的了解，这些改变或许对妊娠诊断的指示有所帮助。生物芯片现已成为快速、高效、高通量取得相关信息的重要手段。随着糖生物学及糖组学研究的进展，糖芯片正发展成为糖生物学及糖组学新兴的检测工具。凝集素芯片检测样品用量少、高通量、灵敏度极高，并且可以与多种检测手段整合使用，可以快速、准确检测出待测样本中糖蛋白糖链的差异，因而可大大提生物芯片结果检测、分析的速度和效率。凝集素芯片是通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以高通量地检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于获得一种简便、准确的鉴别秦岭川金丝猴妊娠的方法，申请人最终通过对秦岭川金丝猴的尿液糖蛋白糖链进行大量的分析、实验，提出了一种特定凝集素探针组合，可用于快速鉴别尿液中糖蛋白糖链的变化，以此有效鉴别秦岭川金丝猴的妊娠状况。该特定凝集素探针组合是PSA、BS-I、GSL-II、DBA和PHA-E+L的组合。当样本检测结果为PSA、BS-I和GSL-II表达上调，且DBA和PHA-E+L表达下调，则表明相应主体在取样时处于妊娠期。该凝集素探针组合可用于制备基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴妊娠的试剂盒，试剂盒中的凝集素芯片上点制有所述凝集素探针组合。进一步的，凝集素芯片上可以增加凝集素LTL和WGA作为内参。利用该凝集素探针组合，基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴妊娠的方法，包括以下步骤：1)取待检秦岭川金丝猴尿液样本，进行蛋白质富集、荧光标记；2)取凝集素芯片，并利用封闭缓冲液对其完成封闭；所述凝集素芯片至少点制有以下五种凝集素：PSA、BS-I、GSL-II、DBA和PHA-E+L；3)将荧光标记的尿液蛋白与孵育缓冲液混匀，然后与凝集素芯片完成孵育；4)扫描凝集素芯片，分析得出对应于所述五种凝集素的糖链表达是否发生显著变化：若样本检测结果为PSA、BS-I和GSL-II表达上调，且DBA和PHA-E+L表达下调，则表明相应主体在取样时处于妊娠期。本专利技术的优点：对于秦岭川金丝猴妊娠状况的鉴别，快速、简便、准确，实现成本较低。附图说明图1为最初设计的凝集素芯片上凝集素探针布局图；图2为妊娠成年雌性(P)，非妊娠成年雌性(NP)尿液蛋白凝集素芯片荧光检测结果；其中，图2(a)对应于妊娠川金丝猴，即表2中的前6个样本，图2(b)对应于未妊娠川金丝猴，即表2中的最后3个样本。具体实施方式1、实验部分1.1试剂与材料甘氨酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，吐温-20和蛋白酶抑制剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。牛血清白蛋白(BSA)购自德国Merck公司。Cy3荧光均购自美国Amerhsma公司。其他化学试剂均为分析纯级别，在使用前没有经过进一步纯化。所有实验用水都为经Milli-Q50纯水系统(美国Millipore公司)处理的超纯水。SephadexG-25柱脱盐购自美国GEHealthcare公司。芯片杂交盒购自美国Bio-Rad伯乐公司。其它常见玻璃器皿均为国产。37种凝集素(具体名称见表1)分别购自Sigma-Aldrich公司、德国Vector公司。表1:凝集素名称及其特异识别糖链1.2实验仪器电热鼓风干燥箱：天津泰斯特公司；高压灭菌锅：日本TOMY公司；超速冷冻离心机5804R：德国Eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪：德国Implen公司；生物芯片扫描仪4000B：美国Axon公司；芯片点样仪：博奥晶芯SmartArrayer48点样仪；芯片杂交箱HL-2000：美国UVP公司。1.3研究对象和尿液采集该实验获得陕西省珍稀野生动物抢救饲养中心的支持，成年雌性金丝猴在5岁以上，2016年12月和2017年2月收集尿液各数例(表2)。表2:成年妊娠雌性、成年非妊娠雌性情况表1.4尿液混合及荧光标记为了消除采集时间上的差异，取相同个体不同时间收集的样品进行混样，进行混合，用3KD超滤膜滤过样本进行蛋白质富集，然后用Brandford法蛋白定量。混合样本经Cy3荧光染料标记后用SephadexG-25除盐柱去掉游离荧光。标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育。1.5凝集素芯片和数据分析1.51凝集素芯片的制备将玻片用无水乙醇清洗三次，每次10min。离心机中甩干玻片。浸泡入250mL10％NaOH溶液中，避光，摇床上反应12h后超声15min。然后用超纯水清洗四次，每次2min，无水乙醇清洗两次，每次2min。甩干。再将玻片浸泡到200mL10％GPTS溶液中，避光，摇床上孵育反应3h，对玻片进行环氧化修饰。超声清洗15min，无水乙醇清洗三次，每次10min。甩干后将玻片置于37℃真空干燥箱中，干燥3h。最后将环氧化玻片放置于室温干燥器中保存备用。设计凝集素芯片矩阵(图1)，选用1mg/mLBSA作阴性质控，Cy3荧光染料标记的BSA作位置标记，与37种凝集素共同构成12×10矩阵，每种凝集素重复点样3次，每张芯片上重复4个矩阵。在384孔板中按矩阵设计顺序依次加入配制好的点样液，使用博奥晶芯48本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴妊娠方面的应用，其特征在于：所述凝集素探针组合为PSA、BS‑I、GSL‑II、DBA和PHA‑E+L的组合；若样本检测结果为PSA、BS‑I和GSL‑II表达上调，且DBA和PHA‑E+L表达下调，则表明相应主体在取样时处于妊娠期。

【技术特征摘要】
1.一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴妊娠方面的应用，其特征在于：所述凝集素探针组合为PSA、BS-I、GSL-II、DBA和PHA-E+L的组合；若样本检测结果为PSA、BS-I和GSL-II表达上调，且DBA和PHA-E+L表达下调，则表明相应主体在取样时处于妊娠期。2.权利要求1中所述的凝集素探针组合在制备基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴妊娠的试剂盒的用途，试剂盒中的凝集素芯片上点制有所述凝集素探针组合。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述凝集素芯片上还点制有凝集素LTL和WGA，作为内参。4.一种基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张思萌，郭松涛，何刚，高更更，张河，于汉杰，张宸，李铮，李保国，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61