一种用牛血清蛋白原位修饰金芯片的方法技术

本发明专利技术涉及一种牛血清蛋白原位修饰金芯片的方法。石英晶体微天平(QCM)和表面等离子体共振仪(SPR)技术是实时、原位研究生物大分子在固体界面的吸附是重要工具，前者同时检测石英晶体频率的变化(对应感应器上的重量)和吸附层的能量耗散值(对应感应器上薄膜的结构)的变化，后者只研究“干物质”的变化。本发明专利技术采用原位修饰的方法在QCM和SPR金芯片上成功修饰一层牛血清蛋白，制备得到牛血清蛋白传感器，为牛血清蛋白的界面吸附建立了一个平台。

【技术实现步骤摘要】
一种用牛血清蛋白原位修饰金芯片的方法
本专利技术涉及牛血清蛋白原位修饰金芯片的方法，属于仪器分析领域。
技术介绍
蛋白质界面吸附现象确实相当普遍，是许多生物学过程必经的一步。例如，跨膜信号和凝血级联系统等生物生理过程以及医学上使用如接骨钢板、人造血管等植入材料经过与人体组织或血液中的蛋白质直接接触，会导致一系列的非生物相容性反应。然而，蛋白质与类似刚性分子的小分子不同，其在固相界面的吸附并不仅仅是界面以一定概率吸附或解吸附。相反，蛋白质复杂的组成和构象源于吸附过程中结构重组、吸附过程中表面亲和力变化、协同效应、排斥作用规模、过冲吸附动力学和表面凝聚等现象。目前，关于蛋白质的吸附仍然存在着大量问题亟待解决。蛋白质在不同界面上的粘附能(如表面张力、极性、电荷、和润湿性)可以通过原子力显微(AFM)或者表面力仪(SFA)直接测得。相对于极性或者低表面张力分子或者不带电基底，蛋白质分子能更好的粘附非极性、高表面张力分子或者带电基底。非极性界面促使蛋白质不稳定，导致构象重排，蛋白质相互之间以及蛋白质与表面间相互作用更加激烈。因此，在大多数情况下蛋白质在疏水基底亲和力较强，而在亲水基底亲和力较低。石英晶体微天平(QCM)和表面等离子体共振仪(SPR)技术是研究生物大分子在固体界面的吸附是非常有利的工具，前者同时检测石英晶体频率的变化(对应感应器上的重量)和吸附层的能量耗散值(对应感应器上薄膜的结构)的变化，后者只研究“干物质”的变化。蛋白质液-固表面的相互作用受界面性质和蛋白质性质共同影响。表面自由能、极性、电荷和形态等都是重要参数。在实验研究中，未经修饰的基底，如石英、云母、玻璃、金属或石墨，经常用于蛋白质吸附研究。运用表面改性来得到合适界面性质的方法也很常用，最常用的改性方法是通过氯硅烷或者羟乙基硅烷与基底羟基发生硅烷化。这样，由石英、玻璃、金属氧化物或者等离子活性硅和金属组成的基底能够在不改变光学性质条件下有效地改性为表面具有目的功能的单层分子的基底。本专利技术涉及一种牛血清蛋白修饰金芯片的方法，先对表面进行修饰，将贵金属基底(黄金等)暴露于硫醇中以达到修改导电基底的目的，然后将牛血清蛋白固定在芯片上，从而制备得到牛血清蛋白传感器，然后应用到其他高分子与牛血清蛋白的相互作用研究中。
技术实现思路
1。一种牛血清蛋白原位修饰金芯片的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤(1)：所用芯片为金表面的QCM或SPR芯片，实验前将金芯片清洗后用氮气吹干，然后放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min；步骤(2)：用75％乙醇为溶剂配制40mM的11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)；步骤(3)：用pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液配制2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的溶液，和50μg/ml的牛血清蛋白溶液；步骤(4)：将步骤(1)清洗并照射后的芯片放置在QCM或SPR流动池内；步骤(5)：首先以0.1ml/min的流速通入75％的乙醇溶液把基线走平；步骤(6)：待平稳后，把步骤(2)中配制的MPA和MUA溶液按体积比10∶1的比例混合后，以0.1ml/min的流速通入QCM或SPR流动池，待检测信号平衡后通入75％乙醇冲洗；步骤(7)：接下来把步骤(3)中配制的EDC和NHSS溶液以体积比1∶1混合，然后以0.1ml/min的流速通入系统，15min后停止通液体；步骤(8)：一小时后重新启动泵，以0.1ml/min的流速通入pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液；步骤(9)：待信号平稳后以0.1ml/min的流速通入步骤(3)配制的牛血清蛋白溶液，待牛血清蛋白吸附平衡后通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的牛血清蛋白，最后得到牛血清蛋白原位修饰的金芯片。具体实施方式实验温度设置为25℃，流速均设置为0.1ml/min。所用芯片为金表面的QCM或SPR芯片，实验前将金芯片清洗后用氮气吹干，然后放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min。溶液配制：用75％乙醇为溶剂配制40mM的11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)；用pH7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液配制2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的溶液，和50μg/ml的牛血清蛋白溶液。修饰程序：将清洗并照射后的芯片放置在QCM或SPR流动池内；首先通入75％的乙醇溶液把基线走平；待平稳后，通入MPA/MUA混合溶液对芯片就行修饰，待检测信号平衡后通入75％乙醇冲洗；接下来通入EDC和NHSS溶液对MPA/MUA进行活化，活化后通入磷酸盐缓冲溶液进行冲洗；接着通入牛血清蛋白液体，牛血清蛋白与活化的MPA/MUA相互作用，吸附到芯片上；待吸附平衡后通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的牛血清蛋白，得到牛血清蛋白原位修饰的金芯片。下面结合实施实例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1所用芯片为金表面的QCM芯片。首先是金芯片的准备：将金芯片清洗后用氮气吹干，放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min，然后将芯片放置在QCM流动池内。然后开始原位修饰程序：首先以0.1ml/min的速率通入75％的乙醇溶液，直到基线走稳。然后以0.1ml/min的速率通入按10∶1(V∶V)的比例混合的40mM的11-巯基十一烷酸(MPA)与40mM的3-巯基丙酸(MUA)的混合溶液。QCM频率下降到大约-8Hz，。平衡后，通入75％乙醇冲洗，频率恢复到-4Hz左右。整个过程能量耗散值(D)变化不到5×10-6。按照Sauerbrey方程计算，MPA/MUA在金芯片上的吸附量大约1.1mg/m2，膜的厚度大约为0.6nm。接下来通入以体积比为1∶1混合的2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的混合溶液15min。然后停止通液体，静止1h使活化充分；QCM监测频率上升到140-150Hz，而相对应的能量耗散值降低到-50～55×10-6。这个QCM的频率和能量耗散变化主要是由于溶剂体系从乙醇体系转化到了磷酸缓冲液体系导致的。活化一小时后通入磷酸盐缓冲溶液进行冲洗。然后是牛血清蛋白的修饰：待平衡后通入浓度为50μg/ml的牛血清蛋白，平衡后再通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的牛血清蛋白，最后得到原位牛血清蛋白修饰的金芯片。由于牛血清蛋白的吸附，QCM监测的频率相应的从约140Hz下降到120Hz左右，按照Sauerbrey方程计算，牛血清蛋白在金芯片上的吸附量大约3.4mg/m2，膜的厚度大约为3nm。整个牛血清蛋白原位修饰QCM金芯片的QCM监测信号如附图1。实施例2所用芯片为金表面的SPR芯片。首先是金芯片的准备：将金芯片清洗后用氮气吹干，放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min，然后将芯片放置在SPR流动池内。然后开始原位修饰程序：首先以0.1ml/min的速率通入75％的乙醇溶液，直到基线走稳，SPR角度大约在72.68°。然后以0.1ml/min的速率通入按10∶1(V∶V)的比例混合的40mM的11-巯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛血清蛋白原位修饰金芯片的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤(1)：所用芯片为金表面的QCM或SPR芯片，实验前将金芯片清洗后用氮气吹干，然后放入紫外‑臭氧清洗机照射10‑30min；步骤(2)：用75％乙醇为溶剂配制40mM的11‑巯基十一烷酸(MUA)与3‑巯基丙酸(MPA)；步骤(3)：用pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液配制2mM的1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N‑羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的溶液，和50μg/ml的牛血清蛋白溶液；步骤(4)：将步骤(1)清洗并照射后的芯片放置在QCM或SPR流动池内；步骤(5)：首先以0.1ml/min的流速通入75％的乙醇溶液把基线走平；步骤(6)：待平稳后，把步骤(2)中配制的MPA和MUA溶液按体积比10∶1的比例混合后，以0.1ml/min的流速通入QCM或SPR流动池，待检测信号平衡后通入75％乙醇冲洗；步骤(7)：接下来把步骤(3)中配制的EDC和NHSS溶液以体积比1∶1混合，然后以0.1ml/min的流速通入系统，15min后停止通液体；步骤(8)：一小时后重新启动泵，以0.1ml/min的流速通入pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液；步骤(9)：待信号平稳后以0.1ml/min的流速通入步骤(3)配制的牛血清蛋白溶液，待牛血清蛋白吸附平衡后通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的牛血清蛋白，最后得到牛血清蛋白原位修饰的金芯片。...

【技术特征摘要】
1.一种牛血清蛋白原位修饰金芯片的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤(1)：所用芯片为金表面的QCM或SPR芯片，实验前将金芯片清洗后用氮气吹干，然后放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min；步骤(2)：用75％乙醇为溶剂配制40mM的11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)；步骤(3)：用pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液配制2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的溶液，和50μg/ml的牛血清蛋白溶液；步骤(4)：将步骤(1)清洗并照射后的芯片放置在QCM或SPR流动池内；步骤(5)：首先以0.1ml/min的流速通入75％的乙醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋君龙，王沛沛，杨益琴，吴淑芳，王志国，任浩，金永灿，戴红旗，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32