一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，该方法包括以下步骤：将桃金娘果实回流提取，得桃金娘果实粗多糖，然后加入30％H2O2溶液脱色；脱色后的多糖加入Sevag试剂去蛋白，得到初步纯化的桃金娘果实多糖；用梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用苯酚‑硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到多糖P1、P2、P3和P4。本发明专利技术建立了一条完整可行的桃金娘果实多糖提取、分离纯化、结构特征和生物活性研究的技术路线，为野生植物资源桃金娘果实多糖的提取分离纯化提供了技术指导。

【技术实现步骤摘要】
一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法
本专利技术涉及一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法。
技术介绍
桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)又名岗稔(广东)、豆稔干(广西)、石都捻子(《本草拾遗》)、倒捻子(《岭表录异》)、倒粘子(《苏沈良方》)等，广泛分布于南亚热带区域；在常绿阔叶林生态系统为优势种，覆盖度30％～60％，呈先锋群落；在中国主要分布于岭南，是我国南方地区主要的林下植被，资源非常丰富，大多生于丘陵坡地、旷野、路边，而且野生桃金娘的分布面积广泛，但目前对其开发利用率较低，加工利用水平也相对较低，桃金娘属于一种尚未进行规模化开发利用的潜在的食品新资源。桃金娘的果实为浆果，成熟时果皮呈紫黑色，果肉则呈紫红色，肉质多汁，营养丰富。有研究表明，野生桃金娘果实成熟时，总糖含量占8.06％、还原糖占7.72％、果胶占1.01％、总酸占0.38％、蛋白质占1.30％、脂肪占0.32％、淀粉占3.08％、粗纤维占34.97％，维生素C含量为5.48mg/kg。桃金娘果实含有多糖类、黄酮类、皂苷类、多酚类、蒽醌类等多种活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抑菌、保肝等生物活性。作为一种野生植物资源，桃金娘在食品加工、保健品开发及医学药物研究等方面有着广阔的开发前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，利用水提醇沉法对桃金娘果实进行多糖提取，并通过离子交换柱层析法对多糖进行分离纯化，由此提取分离出纯度较高、具有生物活性的多糖组分。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，包括以下步骤：(1)提取桃金娘果实多糖：将桃金娘果实烘干并粉碎，取其干粉和蒸馏水于回流装置中煮沸提取数次，合并提取液并减压浓缩，在浓缩液中加入数倍体积的95％(V/V)乙醇，不断搅拌使多糖均匀沉淀，然后在4℃下静置12h以上，离心收集沉淀，烘干后得桃金娘果实粗多糖；步骤(1)所述的煮沸提取，每次的提取时间优选4h；步骤(1)所述的离心优选5000r/min离心15min；(2)H2O2法脱色：取桃金娘果实粗多糖加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0，然后一边滴加30％H2O2溶液，一边搅拌，直至溶液颜色变浅，随后在50℃水浴下保温2h；步骤(2)所述的粗多糖加蒸馏水溶解的浓度优选0.2g/mL；(3)Sevag法脱蛋白：在脱色后的多糖溶液中加入该溶液1/5体积的Sevag试剂，振荡培养20min，静置10min后离心，弃去下层有机相和中间层蛋白质与氯仿和正丁醇生成的凝胶物，重复该离心和弃去有机相、凝胶物的操作若干次；最后一次操作后，旋蒸除去溶液中残留的Sevag试剂，得到脱蛋白后的桃金娘果实多糖溶液，按步骤(1)的醇沉法收集沉淀，烘干后得初步纯化的桃金娘果实多糖；步骤(3)所述的Sevag试剂，是由氯仿和正丁醇按体积比5:1组成；步骤(3)所述的振荡培养，其转速优选150r/min；步骤(3)所述的离心优选4000r/min离心10min；(4)DEAE-Sepharosefastflow离子交换柱层析分离桃金娘果实多糖：DEAE-琼脂糖凝胶填料经预处理后装柱，步骤(3)的初步纯化的桃金娘果实多糖用去离子水溶解后过0.45μm微孔滤膜，然后上柱；用梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到多糖P1、P2、P3和P4；步骤(4)所述的填料预处理包括以下步骤：将填料进行抽滤并且用蒸馏水冲洗，由于在冲洗过程中会产生气泡，之后用超声波进行脱气泡，静置；步骤(4)所述的装柱包括以下步骤：将填料缓慢引流至层析柱(柱规格为1.5cm×20cm)中，柱床体积约为20mL；先用蒸馏水冲洗层析柱1h，再用浓度为1mol/L的NaCl溶液冲洗1h，最后用蒸馏水冲洗2h，即可准备上样；步骤(4)所述的初步纯化的桃金娘果实多糖用去离子水溶解，其浓度优选50mg/mL；步骤(4)所述的上样和洗脱流速优选0.5mL/min；步骤(4)所述的NaCl溶液梯度是0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mol/L；步骤(4)所述的透析是在透析袋(3000Da)中于4℃透析48h。相对于现有技术，本专利技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术建立了一条完整可行的桃金娘果实多糖提取、分离纯化、结构特征和生物活性研究的技术路线，为野生植物资源桃金娘果实多糖的提取分离纯化提供了技术指导。(2)本专利技术所用的水提醇沉法可以完成大量的多糖提取操作，成本较低，重复性好，得率高，适用于工业化大规模生产。(3)本专利技术所用的DEAE-Sepharosefastflow理化稳定性能和机械性能更好，交换容量大，可以在位清洗，床体积随pH值的离子强度变化很小，由于流速和载量高，适合于进行大量粗产品的纯化工作。(4)本专利技术创造性地将多糖的水提醇沉提取方法与离子交换层析分离纯化方法结合起来用于桃金娘果实多糖的研究，比较并得到较优的工艺参数，为桃金娘果实多糖的提取分离纯化提供技术指导和新思路。附图说明图1是桃金娘果实多糖的洗脱曲线图。图2是多糖P1的紫外光谱图。图3是多糖P2的紫外光谱图。图4是多糖P3的紫外光谱图。图5是多糖P4的紫外光谱图。图6是桃金娘果实多糖体外结合胆酸盐能力。图7是多糖P1的红外光谱图。图8是多糖P2的红外光谱图。图9是多糖P3的红外光谱图。图10是多糖P4的红外光谱图。具体实施方式下面结合实施例及图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例中，所得到的桃金娘果实多糖组分P1、P2、P3、P4的分析由中国广州分析测试中心进行，报告编号分别为2017011500-2、2017011500-3、2018000533-1、2018000533-2。实施例1一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，包括以下步骤：(1)提取桃金娘果实多糖：称取110g烘干后的桃金娘果实粉碎，过40目筛后称取100g干粉，加1000mL蒸馏水，于回流装置中煮沸4h，抽滤后，取滤渣再加入1000mL蒸馏水，于回流装置中煮沸4h，合并上清液，减压浓缩。在浓缩液中缓慢加入4倍体积的95％(V/V)乙醇，并不断用玻璃棒搅拌使多糖均匀沉淀，然后放入4℃冰箱静置12h，之后5000r/min离心15min，收集沉淀，烘干后得桃金娘果实粗多糖；(2)H2O2法脱色：称取20g桃金娘果实粗多糖，加100mL蒸馏水溶解，用1％NaOH溶液调节多糖溶液pH值至8.0，然后一边滴加30％H2O2溶液，一边搅拌，直至颜色逐渐变浅，随后在50℃水浴下保温2h；(3)Sevag法脱蛋白：在脱色后的多糖溶液中加入该溶液1/5倍体积的Sevag试剂(氯仿和正丁醇按体积比5:1配制而成)以150r/min转速在摇床上振荡20min，静置10min后离心，弃去下层有机相和中间层蛋白质与氯仿和正丁醇生成的凝胶物，反复5次。最后一次4000r/min离心10min后旋蒸除去溶液中残留的Sevag试剂，得到脱蛋白后的桃金娘果实多糖溶液，按步骤(1)的醇沉法收集沉淀，烘干后得初步纯化的桃金娘果实多糖；(4)DE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将桃金娘果实回流提取，得桃金娘果实粗多糖；(2)桃金娘果实粗多糖加入30％H2O2溶液脱色；(3)脱色后的多糖加入Sevag试剂去蛋白，得到初步纯化的桃金娘果实多糖；(4)DEAE‑琼脂糖凝胶填料经预处理后装柱，步骤(3)的初步纯化的桃金娘果实多糖用去离子水溶解后过0.45μm微孔滤膜，然后上柱；用梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用苯酚‑硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到多糖P1、P2、P3和P4。

【技术特征摘要】
1.一种从桃金娘果实中提取并分离纯化多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将桃金娘果实回流提取，得桃金娘果实粗多糖；(2)桃金娘果实粗多糖加入30％H2O2溶液脱色；(3)脱色后的多糖加入Sevag试剂去蛋白，得到初步纯化的桃金娘果实多糖；(4)DEAE-琼脂糖凝胶填料经预处理后装柱，步骤(3)的初步纯化的桃金娘果实多糖用去离子水溶解后过0.45μm微孔滤膜，然后上柱；用梯度浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到多糖P1、P2、P3和P4。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(1)包括以下操作：将桃金娘果实烘干并粉碎，取其干粉和蒸馏水于回流装置中煮沸提取数次，合并提取液并减压浓缩，在浓缩液中加入数倍体积的95％(V/V)乙醇，不断搅拌使多糖均匀沉淀，然后在4℃下静置12h以上，离心收集沉淀，烘干后得桃金娘果实粗多糖。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(2)包括以下操作：取桃金娘果实粗多糖加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0，然后一边滴加30％H2O2溶液，一边...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄儒强，王静辉，王倩，高林林，张竞雯，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44