一种谷胱甘肽的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种谷胱甘肽的检测方法，具体原理为：由于Ce(IV)离子能够使3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应生成蓝色的TMB亚胺盐。当向Ce(IV)/TMB体系中加入微量谷胱甘肽时，谷胱甘肽与TMB亚胺盐发生还原反应，使体系蓝色变浅，且变浅的程度与谷胱甘肽的浓度有成正比，据此建立了一种检测谷胱甘肽的方法，该方法操作简单，能快速实时的对谷胱甘肽的浓度进行检测。与现有技术相比，本发明专利技术提供的方法操作简单，能快速实时的对谷胱甘肽的浓度进行检测，而且，检测限低，能够到达可低至2μM，检测方法灵敏度高，准确度高、误差小。

A Method for the Detection of Glutathione

The present invention provides a method for detecting glutathione. The principle is that Ce (IV) ion can oxidize 3,3', 5,5'tetramethylbenzidine (TMB) to produce blue TMB imide salt. When trace glutathione was added to Ce(IV)/TMB system, the reductive reaction of glutathione with TMB imide salt made the system blue lighter, and the degree of shallowness was proportional to the concentration of glutathione. Based on this, a method for detecting glutathione was established. This method is simple and can detect the concentration of glutathione in real time. Compared with the prior art, the method provided by the present invention has the advantages of simple operation, fast and real-time detection of glutathione concentration, low detection limit, reaching as low as 2 ugM, high detection sensitivity, high accuracy and small error.

【技术实现步骤摘要】
一种谷胱甘肽的检测方法
本专利技术属于检测领域，具体涉及一种谷胱甘肽的检测方法。
技术介绍
谷胱甘肽(glutathione,r-glutamylcysteingl+glycine,GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性的食品广泛应用。因此，开发设计一种可以检测低浓度谷胱甘肽的方法具有重要的理论价值和应用价值。目前，谷胱甘肽的主要检测方法有酶循环法、比色法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、流式细胞仪法、荧光法等。其中，酶方法对实验条件的要求过高，酶的稳定性对于实验结果影响较大；色谱法操作费时，繁琐复杂；荧光法易受干扰，误差较大；而分光光度法所需仪器价格便宜且操作简便。因此开发一种新的分光光度法检测谷胱甘肽具有很重要的意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种谷胱甘肽的检测方法，由于Ce(IV)离子能够使3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应生成蓝色的TMB亚胺盐。当向Ce(IV)/TMB体系中加入微量谷胱甘肽时，谷胱甘肽与TMB亚胺盐发生还原反应，使体系蓝色变浅，且变浅的程度与谷胱甘肽的浓度有成正比，据此建立了一种检测谷胱甘肽的方法，该方法操作简单，能快速实时的对谷胱甘肽的浓度进行检测。本专利技术具体技术方案如下：一种谷胱甘肽的检测方法，具体为：将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺TMB溶液和Ce(IV)溶液混合，然后分别加入不同量的谷胱甘肽溶液，分别测量吸光度，构建吸光度与谷胱甘肽浓度的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的谷胱甘肽。进一步的，所述检测方法在22-27℃条件下进行。进一步的，检测时，体系中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺TMB终浓度大于80μM，优选的为90μM。检测时，体系中Ce(IV)的终浓度为60μM。进一步的，检测时，体系中谷胱甘肽最终浓度分别为:0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM和18μM。进一步的，测量吸光度前，调节体系pH至3.0～7.0，优选的，调节pH至6.0。进一步的，测量的是654nm处的吸光强度。进一步的，构建的线性关系为：线性方程A＝0.496-0.022C且线性相关系数R2为-0.998。优选的，具体检测方法为：取270μL0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺TMB溶液和90μL1mMCe(IV)溶液混合，重复上述体系10份，分别加入0μL、30μL、60μL、90μL、120μL、150μL、180μL、210μL、240μL和270μL的0.1mM的谷胱甘肽溶液，再各加入50μL0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至PH＝6，加入去离子水定容至1.5mL，谷胱甘肽终浓度分别为:0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM和18μM，使用紫外可见分光光度计分别测量体系654nm处吸光度，得到谷胱甘肽终浓度与吸光强度之间的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的谷胱甘肽。本专利技术提供了一种操作简便的谷胱甘肽检测方法，具体原理为：将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液和Ce(IV)混合摇匀。由于Ce(IV)的氧化作用，使3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应立刻生成蓝色的TMB亚胺盐，使体系颜色从无色变为蓝色。然后，再往该体系中加入一定量的谷胱甘肽，由于谷胱甘肽的还原作用，使体系的TMB亚胺盐发生还原反应立刻生成无色的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。因此随着谷胱甘肽浓度的增加，体系蓝色逐渐变浅，在一定的浓度范围内，体系蓝色变浅的程度与谷胱甘肽的浓度有成正比，据此建立了一种检测谷胱甘肽的方法，该方法操作简单，能快速实时的对谷胱甘肽的浓度进行检测，检测示意图如图1所示。与现有技术相比，本专利技术提供的方法操作简单，能快速实时的对谷胱甘肽的浓度进行检测，而且，检测限低，能够到达可低至2μM，检测方法灵敏度高，准确度高、误差小。附图说明图1为谷胱甘肽检测示意图；图2为体系中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)终浓度与吸光度的关系；图3为654nm处的吸光强度的变化(△A)与PH的关系，谷胱甘肽的浓度:4μM；图4为不同浓度谷胱甘肽(从上至下依次为0–18μM)与溶液吸光度的变化图；图5为谷胱甘肽浓度在0–18μM范围内的线性关系；图6为3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液与Ce(IV)混合溶液对于谷胱甘肽选择性和抗干扰性，干扰溶液浓度均为50μM，谷胱甘肽浓度为16μM。。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进一步说明。使用试剂的配置：3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液的制备：将0.0601g3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)用95％乙醇溶解，并超声震荡3分钟，然后将其转移至50ml容量瓶中并使用95％乙醇定容至刻度，即配制为5.0mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液，使用时将5.0mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液用去离子水稀释十倍使用，即3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液的浓度为0.5mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的制备：取2.1013g柠檬酸(C6H8O7·H2O)和2.9421g柠檬酸钠(Na3C6H5O7.2H2O)，用去离子水溶解，超声震荡3分钟，然后将其分别转移至100mL容量瓶并定容，即配制为0.1M的柠檬酸溶液和0.1M的柠檬酸钠溶液，将其配制为系列不同pH的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。实施例1一种谷胱甘肽的检测方法，具体为：在25℃下，取270μL0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺TMB溶液和90μL1mM硫酸高铈溶液混合在一系列试管中混合，重复上述体系10份，分别加入0μL、30μL、60μL、90μL、120μL、150μL、180μL、210μL、240μL和270μL的0.1mM的谷胱甘肽溶液，再各加入50μL0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至PH＝6，加入去离子水定容至1.5mL，谷胱甘肽终浓度分别为:0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM和18μM，向上述体系中加入谷胱甘肽溶液后，体系的蓝色逐渐变浅，且变浅的程度与谷胱甘肽的加入量有关。谷胱甘肽在一定浓度范围内，溶液的吸光度与谷胱甘肽的加入的浓度呈线性关系(图4,图5)，得到谷胱甘肽浓度与654nm处的吸光强度之间的线性方程A＝0.496-0.022C且线性相关系数R2为-0.998，对于谷胱甘肽的检测限可低至2μM。据此建立了一种谷胱甘肽的检测方法，该方法操作简便，能够快速的对谷胱甘肽进行检测。检测条件优化：3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液最适浓度的确定：取90μL1mM的硫酸高铈溶液于试管中，重复11组，分别向其中加入30μL、60μL、90μL、120μL、150μL、180μL、210μL、240μL、270μL、300μL、330μL的0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液，并用去离子水定容至1.5mL，该系列溶液中3,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体为：将3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺TMB溶液和Ce(IV)溶液混合，然后分别加入不同量的谷胱甘肽溶液，分别测量吸光度，构建吸光度与谷胱甘肽浓度的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的谷胱甘肽。

【技术特征摘要】
1.一种谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体为：将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺TMB溶液和Ce(IV)溶液混合，然后分别加入不同量的谷胱甘肽溶液，分别测量吸光度，构建吸光度与谷胱甘肽浓度的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的谷胱甘肽。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测时，体系中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺TMB终浓度大于80μM。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，检测时，体系中Ce(IV)的终浓度为60μM。4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，检测时，体系中谷胱甘肽最终浓度分别为:0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM和18μM。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，测量吸光度前，调节体系pH至3.0～7.0。6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，调节pH至6.0。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，测量的是654nm处的吸光强度。8.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪鹏敏，刘金水，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34