一种新型比率型免标记荧光传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型比率型免标记荧光生物传感器用于超灵敏高特异性检测铅离子(Pb

A New Ratio-type Label-free Fluorescence Sensor and Its Application

The invention discloses a novel ratio-type label-free fluorescent biosensor for ultra-sensitive and highly specific detection of lead ion (Pb).

【技术实现步骤摘要】
一种新型比率型免标记荧光传感器及其应用
本专利技术涉及化学分析领域，具体涉及一种重金属Pb2+的快速检测方法。本专利技术属于检测

技术介绍
铅离子(Pb2+)是一种不可降解的环境污染物，对人体健康的危害十分严重。例如，血液中即使存在微量的Pb2+也会对人体造成不可逆的脑损伤和精神发育的迟滞，特别是对于血脑屏障尚不完善的婴幼儿和儿童而言，其危害更甚。因此，开发可靠的超灵敏的Pb2+传感器来实现环境和生物样品中的Pb2+检测具有重要的意义。目前对于重金属Pb2+检测方法的文献报道较多(ChemicalCommunications,2015，51，979-995.；J.Am.Chem.Soc.,2007，129，262-263.；AnalyticalChemistry,2012，84，3703-3709.；ChemicalCommunications,2011，47，6278-6280.；Analyst,2014，139，6326-6342.)，大多数是基于“8-17”DNAzyme的设计，利用不同的读出信号，如电化学，比色法和荧光技术实现对Pb2+的检测。其中荧光检测技术因具有超高的灵敏度而备受关注，然而单一荧光信号的荧光探针具有不可忽视的缺点，容易受环境因素影响从而产生假阴性或假阳性结果。因此，亟需开发出新型荧光探针用于Pb2+的超灵敏检测。比率型荧光探针具有内校正性质，可以有效消除环境因素的影响。基于以上考虑，我们开发了一种免标记、特异性强、稳定性好、检测速度快、操作简单且成本低的快速Pb2+检测方法。其检测结果具有良好的重现性，确保了检测结果的准确度。
技术实现思路
本专利技术针对Pb2+检测的重大需求，设计并合成出适用于现场快速、准确检测实际样品中低浓度Pb2+的新型比率型免标记荧光传感器。该体系也可进一步应用于研制相关试剂盒、试纸条。为达到上述目的，本专利技术创造的技术方案如下：本方法将DNA为模板的银纳米团簇与Pb2+依赖的DNA酶相结合，基于Pb2+对其特异性识别位点的切割，在加入Pb2+室温孵育3.5h后，使得ds-DNA-AgNCs荧光发生变化，其荧光强度比值(F560/F685)与Pb2+浓度的对数呈现线性关系，可用于标准样品和实际样品中Pb2+的定量检测。本专利技术Pb2+生物传感器的构建具体包括以下步骤：(1)G-DNA-AgNCs纳米团簇的合成：首先将0.5μMG-DNA模板进行退火处理(90℃，8min)，降至室温后加入3.0μMAgNO3溶液和3.0μMNaBH4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。生成的G-DNA-AgNCs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度F560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度F685；(2)Pb2+传感体系的构建：在G-DNA-AgNCs体系中加入R-DNA进行杂交反应，形成由G-DNA与R-DNA，双链的G-DNA/R-DNA为模板的银纳米团簇(命名为ds-DNA-AgNCs)，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强。本专利技术所构建新型比率型免标记荧光传感器用于快速检测Pb2+。本专利技术新型比率型免标记荧光传感器的应用，用于快速检测Pb2+的具体方法是：(1)所述ds-DNA-AgNCs传感体系中G-DNA包含形成Pb2+特异切割位点的DNAzyme序列G1及可结合AgNCs的模板序列G2；R-DNA包含有与G1互补的R1序列、Pb2+可切割位点的rA序列及与G2-1部分互补的模板R2-1序列，R-DNA被分裂为两部分，其中R2部分从ds-DNA-AgNCs中释放，导致685nm处荧光降低，而560nm处荧光得到显著恢复，以F560/F685为检测信号，以Pb2+浓度的对数为横坐标对检测数据进行处理，通过拟合得到线性回归方程；(2)检测实际样品时在待测样品溶液中加入ds-DNA-AgNCs和不同浓度的Pb2+，室温孵育3.5小时后，用荧光分光光度仪检测ds-DNA-AgNCs的荧光强度，激发波长为470nm、610nm，发射波长为560nm、685nm；根据步骤(1)得到的线性回归方程计算样品中Pb2+的浓度。因为所获得的实际水样、血样中不含有铅离子。所以需要人为的进行添加，以模拟实际样品中铅离子的检测，用以说明本专利技术的方法的准确性和有效性。本专利技术所述的是一种快速检测Pb2+的新方法。相对于现有技术，本专利技术创造所述的Pb2+的检测方法具有以下优势：本专利技术将具有Pb2+特异性的DNA模板与银纳米团簇相结合(ds-DNA-AgNCs)，制备了有Pb2+响应的比率型荧光探针，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测速度快、免标记、操作简单且成本低的优势。附图说明构成本专利技术创造的附图用来提供对本专利技术创造的进一步理解，本专利技术创造的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术创造，并不构成对本专利技术创造的不当限定。在附图中：图1为本专利技术创造实施例所述的ds-DNA-AgNCs单荧光团比率型探针用于Pb2+的超灵敏检测的原理验证相关实验数据。图2为本专利技术创造实施例所述的ds-DNA-AgNCs的透射电子显微镜。图3为本专利技术创造实施例所述DNA-AgNCs溶液中G2-1和R2-1碱基互补数对检测Pb2+生物传感体系的影响。图4为本专利技术创造实施例所述的检测Pb2+所用缓冲溶液pH的优化实验。图5为本专利技术创造实施例所述的在传感体系中加入Pb2+后反应时间的优化实验。图6为本专利技术创造实施例所述的ds-DNA-AgNCs生物传感体系对不同浓度Pb2+的荧光响应。图7为本专利技术创造实施例所述的方法检测Pb2+的特异性验证实验数据。具体实施方式为了使本专利技术上述特征和专利技术创造中优化条件更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本专利技术的实施方式作进一步详细描述。以下ds-DNA-AgNCs与Pb2+二者反应的体系为300μL(包括DNA-AgNCs和不同浓度的Pb2+)，下面给出二者的浓度都是在300μL体系下的浓度。实施例1(1)G-DNA-AgNCs纳米团簇的合成：首先将0.5μMG-DNA模板进行退火处理(90℃，8min)，降至室温后加入3.0μMAgNO3溶液和3.0μMNaBH4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。生成的G-DNA-AgNCs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度F560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度F685；(2)Pb2+传感体系的构建：在G-DNA-AgNCs体系中加入R-DNA进行杂交反应，形成由G-DNA与R-DNA，双链的G-DNA/R-DNA为模板的银纳米团簇(命名为ds-DNA-AgNCs)，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强。本专利技术所构建新型比率型免标记荧光传感器用于快速检测Pb2+。传感体系荧光响应验证Pb2+检测原理：如图1所示，实施例1得到的G-DNA-AgNCs在560nm和685nm的特征峰(a和a')，此时该探针在560nm处响应比较强，因此呈本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型比率型免标记荧光检测铅离子的新方法，其特征在于：以合成的DNA保护的银纳米团簇为分子探针所构建的传感体系，可实现对水样和血样中铅离子的高灵敏度高特异性检测。

【技术特征摘要】
1.一种新型比率型免标记荧光检测铅离子的新方法，其特征在于：以合成的DNA保护的银纳米团簇为分子探针所构建的传感体系，可实现对水样和血样中铅离子的高灵敏度高特异性检测。2.根据权利要求1所述一种新型比率型免标记荧光检测铅离子的新方法，其特征在于：(1)G-DNA-AgNCs纳米团簇的合成：将G-DNA模板进行退火处理后，加入AgNO3溶液和NaBH4溶液进行反应，生成G-DNA-AgNCs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度F560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度F685；(2)Pb2+传感体系的构建：在G-DNA-AgNCs体系中加入R-DNA进行杂交反应，形成由G-DNA与R-DNA双链的G-DNA/R-DNA为模板的银纳米团簇ds-DNA-AgNCs，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强；(3)铅离子检测：在ds-DNA-AgNCs传感体系中加入的铅离子引起R-DNA分裂成两部分，其中所含的R2部分从ds-DNA-AgNCs中释放，引起银纳米团簇在560nm处的荧光增强，而685n...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚青，王娇，王硕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12