一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法技术

本发明专利技术涉及牛毛检测技术领域，公开了一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。本发明专利技术先采用酸性洗毛的工艺去除牛毛的油脂、杂质，将牛毛分组，然后利用排列组合的方法用不同蛋白酶对牛毛由外向内依次酶解，对于仅用过酸性蛋白酶酶解的牛毛用三(2‑羧乙基)膦特异地断裂二硫键，先用氨基酸分析对未断二硫键的各组牛毛进行氨基酸的测定，得到氨基酸在牛毛角蛋白中的径向分布，再对比断裂二硫键前后的组别，得到氨基酸键合折叠分布。本发明专利技术根据牛毛角蛋白中氨基酸分布具有不同层次的特点，采用排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，对氨基酸的破坏小，准确性高，特异性强，方法较为环保。

A Method for Analyzing the Folding Distribution of Amino Acids in Bovine Hair Keratin

The invention relates to the field of cattle hair detection technology, and discloses a method for analyzing the folding distribution of amino acid bonds in cattle hair keratin. The invention first uses acid wool washing process to remove grease and impurities of cattle hair, divides cattle hair into groups, then enzymatic hydrolysis of cattle hair by different proteases from outside to inside in turn, and specifically breaks disulfide bond with tris(2 carboxyethyl)phosphorus for cattle hair hydrolyzed only by Superacid protease. The amino acid analysis is used to determine the amino acid of each group of cattle hair with uninterrupted disulfide bond. The radial distribution of amino acids in bovine hair keratin was determined, and then the folding distribution of amino acids was obtained by comparing the groups before and after disulfide bond breaking. According to the characteristics of different levels of amino acid distribution in bovine hair keratin, the method adopts multiple enzymatic hydrolysis of arrangement and combination to dissolve keratin, which has small damage to amino acid, high accuracy, strong specificity and environmental protection.

【技术实现步骤摘要】
一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法
本专利技术涉及牛毛检测
，尤其涉及一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。
技术介绍
牛毛纤维从分子组成上看主要是由角蛋白组成。角蛋白是牛毛的主要成分，是可再生蛋白的重要来源，角蛋白具有很好的生物相容性，广泛的应用于生物医药行业;角蛋白是由多种氨基酸构成结构复杂的大分子物质，因此经水解后可得到种类繁多的氨基酸，可应用于饲料、食品、医药和保健品等行业。牛毛是细长的实心圆柱体，呈卷曲状，纤维的组织结构分三层，即鳞片层、皮质层和髓质层。皮质层是牛毛纤维的主要组成部分，由许多角蛋白组成。细胞之间互相粘合，中间存在空隙。皮质层是决定牛毛纤维物理、机械和化学性质的主要部分。皮质层分为正皮质层和副皮质层两种。溶解牛毛提取角蛋白是解决资源短缺和资源浪费的重要手段。但是牛毛角蛋白的结构十分复杂，主要以a-螺旋、β-折叠形式存在，其中a-螺旋结构占角蛋白一半以上。牛毛角蛋白大分子是由十八种氨基酸通过肽键连接构成多肽长链，同时在这些长链中，又含有氢键、二硫键、盐式键等多种键能使角蛋白具有稳定的空间结构。而其中，对牛毛角蛋白结构稳定做出最大贡献的是二硫键。这些复杂的化学结构为人们牛毛角蛋白的提取增加了无尽的困难，因此，解析牛毛角蛋白中氨基酸的分布，特别是二硫键稳定的键合折叠的氨基酸分布，就显得尤为重要。另外，解析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布，更有利于帮助我们推测蛋白质的高级结构。但是现有技术中关于牛毛角蛋白中氨基酸分布的分析较少，仅有学者通过使用酸、碱溶液或各种蛋白酶对牛毛角蛋白进行不同程度（通过控制水解/酶解时间的长短来实现径向上的逐层侵蚀）的溶解，以得到残余的角蛋白纤维，再采用红外光谱、X射线衍射等技术分析角蛋白中氨基酸径向分布。但上述溶解方法容易损伤氨基酸，并且容易对角蛋白内层暂时不希望被水解的蛋白质造成误水解/酶解，从而造成分析结果不够准确。此外，上述方法还无法进行较详细的定量研究，难以应用到牛毛角蛋白的氨基酸分析中。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。本专利技术根据牛毛角蛋白纤维径向上氨基酸分布的特点，通过排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，利用针对性极强的还原剂断裂二硫键，易于分析，特异性强，结果准确，条件温和，对氨基酸的破坏小。本专利技术的具体技术方案为：一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，包括以下步骤：1）称取牛毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干、2）将烘干的样品在50-60℃下，以1:95-105的浴比加入至0.06-0.08wt%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中，用醋酸调节pH至6-6.5，煮25-35min，洗除油脂、杂质，重复一次、3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，在40-50℃下干燥，得到烘干的牛毛。本专利技术洗除油脂的过程，采用酸性洗毛的工艺，适合用于土壤含盐、碱较多的高原地带，土杂含量高的牛毛。土杂多为碱性，加入适量的醋酸，可以中和土杂的碱性，减小对牛毛角蛋白的损伤，同时更好地避免了碱性条件下，二硫键的易位。4）将步骤3）烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量份的组别，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min。5）将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余牛毛；将B2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min。本专利技术对于弱酸性条件下酶解的牛毛，用三(2-羧乙基)膦进行精确的二硫键断裂，形成断裂了二硫键的残余牛毛。弱酸性条件下酶解，避免了碱性条件下二硫键的易位。将保留原始二硫键位置的牛毛角蛋白断裂二硫键，和同样酶解条件下未断裂二硫键的组别进行对比，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余牛毛；将C2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min、7）将步骤6）酶解过的D1、D2、E组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1组残余牛毛；将D2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min、8）将步骤7）酶解过的E组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理、9）将F1、F2、G、H组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余牛毛；将F2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min、10）将步骤9）酶解过的G、H组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛、11）将步骤10）酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理、12）将I1、I2、J1、J2、K组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留I1组残余牛毛；将I2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min、13）将步骤12）酶解过的J1、J2、K组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留J1组残余牛毛；将J2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；14）将步骤13）酶解过的K组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理。通过排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，形成多组可以横向比较的对比组别，易于分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于包括以下步骤：1）称取牛毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干；2）将烘干的样品在50‑60℃下，以1:95‑105的浴比加入至0.06‑0.08wt%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中，用醋酸调节pH至6‑6.5，煮25‑35min，洗除油脂、杂质，重复一次；3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，在40‑50℃下干燥，得到烘干的牛毛；4）将步骤3）烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量份的组别，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L 三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:19‑21的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；5）将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余牛毛；将B2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:19‑21的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余牛毛；将C2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:19‑21的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；7）将步骤6）酶解过的D1、D2、E组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1组残余牛毛；将D2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:19‑21的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；8）将步骤7）酶解过的E组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；9）将F1、F2、G、H组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余牛毛；将F2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L 三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:19‑21的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；10）将步骤9）酶解过的G、H组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛；11）将步骤10）酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；12）将I1、I2、J1、J2、K组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留I1组残余牛毛；将I2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L 三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:19‑21的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；13）将步骤12）酶解过的J1、J2、K组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留J1组残余牛毛；将J2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L 三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:19‑21的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；14）将步骤13）酶解过的K组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；15）对A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K组酶解后的残余牛毛进行过滤和洗涤处理，得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余牛毛；16）利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余牛毛进行氨基酸分析，对比A1、B1、C1、D1、E、F1、G、H、I1、J1、K，分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布；17）在分析出牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下，对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、D1和D2、F1和F2、I1和I2、J1和J2，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。...

【技术特征摘要】
1.一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于包括以下步骤：1）称取牛毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干；2）将烘干的样品在50-60℃下，以1:95-105的浴比加入至0.06-0.08wt%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中，用醋酸调节pH至6-6.5，煮25-35min，洗除油脂、杂质，重复一次；3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，在40-50℃下干燥，得到烘干的牛毛；4）将步骤3）烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量份的组别，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；5）将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余牛毛；将B2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余牛毛；将C2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；7）将步骤6）酶解过的D1、D2、E组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1组残余牛毛；将D2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；8）将步骤7）酶解过的E组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；9）将F1、F2、G、H组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余牛毛；将F2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；10）将步骤9）酶解过的G、H组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛；11）将步骤10）酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；12）将I1、I2、J1、J2、K组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留I1组残余牛毛；将I2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；13）将步骤12）酶解过的J1、J2、K组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留J1组残余牛毛；将J2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秉，王钟元，尚亚廷，周莲，杨慧，彭志勤，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33