一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，包括以下步骤：采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原得到纤维蛋白原溶液，浓度30～100mg/ml；采用凝血酶溶解液溶解凝冻干血酶，得到凝血酶的细胞混悬液，浓度200～800IU/ml，将1ml浓度为10

【技术实现步骤摘要】
一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法
本专利技术涉及种子细胞移植
，具体涉及一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法。
技术介绍
目前临床上进行种子细胞移植修复手术所采用的细胞固定方式主要包括生物胶原膜固定或者壳聚糖水凝胶等细胞支架材料固定。处于实验室研究过程中的细胞支架材料品种繁多，目前主要的天然生物支架材料有胶原、壳聚糖、明胶、丝素蛋白等。但是这些材料存在各种各样的问题：例如，部分支架材料具有诱导种子细胞的去分化作用；降解过快或过慢,从而影响细胞的迁移和修复效果；有的支架材料需要体外先进行塑形，然后再吸附细胞进行移植，操作过程复杂，临床应用过程中的可能性差。有鉴于此，急需对现有的支架进行改进，以方便操作，延长降解时间，提高修复效果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是现有的种子细胞支架材料操作不便，降解时间短，修复效果差的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是提供一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，包括以下步骤：采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原,得到纤维蛋白原溶液，所述纤维蛋白原溶液浓度为30～100mg/ml；采用凝血酶溶解液溶解冻干凝血酶，得到凝血酶混悬液，所述凝血酶混悬液的浓度为200～800IU/ml；将1ml浓度为105～107/ml的种子细胞的细胞培养液与0.01～0.5ml的凝血酶混悬液混匀，得到含有凝血酶的种子细胞混悬液；采用双路注射器将1～2ml纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液，等体积均匀注射入损伤部位，在损伤部位凝固后形成在体修复用细胞移植的支架材料，在双路注射器向损伤部位注射期间，按照损伤区域的形状进行塑形和修补，使凝胶形状与损伤缺口相契合。在另一个优选的实施例中，纤维蛋白原溶解液采用浓度为0.9％的氯化钠。在另一个优选的实施例中，凝血酶溶解液采用浓度为1～3mg/ml的氯化钙。在另一个优选的实施例中，所述种子细胞包括但不限于：软骨细胞、干细胞。在另一个优选的实施例中，纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液注射入损伤部位后2～5min内凝固。在另一个优选的实施例中，注射凝固后，形成孔径为100～200μm的纤维蛋白胶孔径。与现有技术相比，利用纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液形成纤维蛋白凝胶，并采用纤维蛋白凝胶作为种子细胞的支架结构，不仅能很好地固定种子细胞，给种子细胞提供良好的生长空间，方便营养成分渗入，还能促进种子细胞的生长发育增殖；在手术操作的过程中，操作简便，医生可在清创空间内自由塑形；并能够在种子细胞完成与病变部位的融合修复后完全降解，安全可靠；特别适合临床上医生对于损伤部位进行清创后，通过种子细胞的移植进行再生修复，特别适用于软骨细胞或者干细胞的移植。附图说明图1为本专利技术的操作流程图；图2为本专利技术中纤维蛋白胶的降解速度及所支持的移植细胞的活力情况；图3为软骨细胞在本专利技术制备的纤维蛋白凝胶中的细胞活力情况的长时间观察的实验图；图4为软骨细胞在本专利技术制备的纤维蛋白凝胶中的细胞长期培养后在显微镜明场条件下的状态实验图；图5为实验用家兔在移植前的软骨损伤情况；图6为本专利技术制备的纤维蛋白凝胶为支架材料在家兔的软骨修复的情况；图7为未受损伤的家兔正常软骨组织切片的HE染色结果；图8为采用本专利技术方法配制的纤维蛋白凝胶作为支架进行家兔软骨细胞移植修复后的在体的HE染色结果；图9为膝关节损伤病人在移植前的软骨情况；图10为采用本专利技术的方法进行软骨细胞移植对于膝关节损伤病人产生的修复结果。具体实施方式本专利技术提供了一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，给种子细胞提供良好的生长空间，方便营养成分渗入，并能保证种子细胞自由迁移，对损伤处进行修复；降解时间长，能够进行有效修复；在种子细胞进行修复后能够完全降解，在病人体内没有残留。下面结合说明书附图和具体实施方式对本专利技术做出详细说明。如图1所示，本专利技术提供的一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，包括以下步骤：采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原,得到纤维蛋白原溶液，所述纤维蛋白原溶液浓度为30～100mg/ml；采用凝血酶溶解液溶解冻干凝血酶，得到凝血酶混悬液，所述凝血酶混悬液的浓度为200～800IU/ml；将1ml浓度为105～107/ml的种子细胞的细胞培养液与0.01～0.5ml的凝血酶混悬液混匀，得到含有凝血酶的种子细胞混悬液；采用双路注射器将1～2ml纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液，等体积均匀注射入损伤部位，在损伤部位凝固后形成在体修复用细胞移植的支架材料，在双路注射器向损伤部位注射期间，按照损伤区域的形状进行塑形和修补，使凝胶形状与损伤缺口相契合。其中，纤维蛋白原溶解液采用浓度为0.9％的氯化钠。其中，凝血酶溶解液采用浓度为1～3mg/ml的氯化钙。其中纤维蛋白原溶解液和凝血酶溶解液可采用市面上的安可晶套盒。纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液注射入损伤部位后2～5min内凝固，凝固时间既能为医生塑形提供足够的时间，又能保证尽快凝固提高手术效果。注射凝固后，形成孔径为100～200μm的纤维蛋白胶孔径，大小适中，可以给种子细胞提供充足的营养成分渗入的空间，并能保证种子细胞自由进行迁移，对损伤处进行修复留。本专利技术中的种子细胞包括但不限于：软骨细胞、干细胞，适用于可进行移植修复的各类种子细胞，现以软骨细胞为例来进行详细阐述。采用本专利技术的步骤来制备支架材料，用于自体同源的软骨细胞移植手术(autologouschondrocyteimplantation，ACI)，并对本专利技术进行如下的检测和观察：一、本专利技术中纤维蛋白胶的降解速度及所支持的移植细胞的活力情况。如图2所示，观察血清条件下纤维蛋白胶降解时间，与采用LIVE/DEADViability/Cytotoxicitykit方法检测细胞活力；由上至下依次为1天、5天、7天的检测结果，凝胶降解时间超过10天，细胞活力均大于80％。二、软骨细胞在本专利技术制备的纤维蛋白凝胶中的存活情况。如图3和图4所示，软骨细胞在本专利技术所推荐的浓度配比下配制的纤维蛋白三维凝胶中体外生长12天，图2为细胞活力实验图，图3为显微镜明场条件下的观测图像，图2和图3的放大倍数为100倍，可清楚看到细胞生长状态良好，活力大于80％。三、本专利技术制备的纤维蛋白凝胶为支架材料在家兔的软骨修复的情况。如图5和图6所示，采用本专利技术的纤维蛋白凝胶作为支架进行软骨细胞移植手术，在家兔的动物模型中，由左至右依次为移植手术前后，从两个图的标注圆圈内，可看到软骨得到明显修复。四、采用本专利技术方法配制的纤维蛋白凝胶作为支架进行家兔软骨损伤修复的HE染色结果。采用本专利技术的纤维蛋白凝胶作为软骨细胞移植支架，进行家兔软骨损伤模型的移植修复手术,所修复形成的软骨成份主要为透明胶原。如图6所示，HE染色显示(×200)：正常未受损伤的软骨组织切片显示，软骨细胞位于软骨陷窝内，成柱状排列；如图7所示，HE染色显示(×200)，采用纤维蛋白原凝胶支架材料进行细胞移植修复手术后3个月，所修复产生的软骨细胞主要为透明软骨，并与正常组织类似。图7和图8的标尺为2μm。五、采用本专利技术的方法进行软骨细胞移植对于膝关节损伤病人产生的修复结果。采用哈尔滨翰邦医疗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原,得到纤维蛋白原溶液，所述纤维蛋白原溶液浓度为30～100mg/ml；采用凝血酶溶解液溶解冻干凝血酶，得到凝血酶混悬液，所述凝血酶混悬液的浓度为200～800IU/ml；将1ml浓度为105～107/ml的种子细胞的细胞培养液与0.01～0.5ml的凝血酶混悬液混匀，得到含有凝血酶的种子细胞混悬液；采用双路注射器将1～2ml纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液，等体积均匀注射入损伤部位，在损伤部位凝固后形成在体修复用细胞移植的支架材料，在双路注射器向损伤部位注射期间，按照损伤区域的形状进行塑形和修补，使凝胶形状与损伤缺口相契合。

【技术特征摘要】
1.一种在体修复用细胞移植的支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用纤维蛋白原溶解液溶解冻干纤维蛋白原,得到纤维蛋白原溶液，所述纤维蛋白原溶液浓度为30～100mg/ml；采用凝血酶溶解液溶解冻干凝血酶，得到凝血酶混悬液，所述凝血酶混悬液的浓度为200～800IU/ml；将1ml浓度为105～107/ml的种子细胞的细胞培养液与0.01～0.5ml的凝血酶混悬液混匀，得到含有凝血酶的种子细胞混悬液；采用双路注射器将1～2ml纤维蛋白原溶液和含有凝血酶的种子细胞混悬液，等体积均匀注射入损伤部位，在损伤部位凝固后形成在体修复用细胞移植的支架材料，在双路注射器向损伤部位注射期间，按照损伤区域的形状进行塑形和修补，使凝胶形状与损伤缺口相契合。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王君，郑吉练，
申请(专利权)人：天和祥生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11