一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用，属于鲤鱼细胞培养技术领域。为了解决鲤鱼三倍体细胞生长需求的问题，本发明专利技术提供了一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子‑1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4‑羟乙基哌嗪乙磺酸。本发明专利技术能减少了细胞污染，简化提纯和鉴定各种细胞产物的程序，适用于鲤鱼三倍体细胞的培养。
A Serum-free Medium for Growth of Triploid Carp Cells and Its Application
The utility model relates to a serum-free medium suitable for the growth of triploid carp cells and its application, belonging to the technical field of carp cell culture. In order to solve the problem of growth demand of triploid carp cells, the present invention provides a serum-free medium suitable for triploid carp cells. The serum-free medium includes DMEM basic medium, culture additives and antibiotics. The culture additives include recombinant human insulin-like growth factor 1, recombinant human basic fibroblast growth factor and platelet source. Sexual growth factors, bovine serum albumin, bovine transferrin, fibronectin, non-essential amino acids and 4 -hydroxyethyl piperazine ethylsulfonic acid. The invention can reduce cell pollution, simplify the procedure of purifying and identifying various cell products, and is suitable for the culture of triploid cells of carp.
【技术实现步骤摘要】
一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用
本专利技术涉及鲤鱼细胞培养
，具体涉及一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用。
技术介绍
细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。体外培养细胞在使用合成培养基时需要添加一些天然成分，其中最重要的是血清，血清所含成分复杂，不同批次血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差，需要大量验证工作；血清存在污染外源病毒和致病因子的风险，容易被病毒和支原体感染；含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，影响细胞生长和细胞某些功能的表达，对某些细胞的体外培养有去分化作用。市面上出售的培养基的组成成分，建立在对不同细胞系生长的研究之上的。三倍体细胞相对于二倍体细胞，具有细胞体积大、营养需求量大的特点，实验人员曾用市面上的培养基对三倍体细胞进行培养，会出现细胞生长缓慢、贴壁率低、传代时间长等问题，不利于三倍体细胞的培养。目前并没有专门针对鲤鱼三倍体体细胞培养的专用培养基，不能完全满足三倍体体细胞的生长要求，对三倍体体细胞的培养效果总是不很理想。
技术实现思路
为了解决鲤鱼三倍体细胞生长需求的问题，本专利技术提供了一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子-1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸。进一步地限定，所述无血清培养基由DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素组成，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.21-0.35μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.24-0.33μg、血小板源性生长因子0.20-0.27μg、牛血清白蛋白4.71-5.90mg、牛转铁蛋白6.30-7.51mg、纤粘连蛋白0.81-1.32mg、非必需氨基酸1.90-2.51mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.303-2.402g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。优选地，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.30μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.30μg、血小板源性生长因子0.22μg、牛血清白蛋白5.3mg、牛转铁蛋白6.8mg、纤粘连蛋白1.0mg、非必需氨基酸2.2mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.383g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。进一步地限定，所述抗生素为青霉素和链霉素，所述青霉素在每升无血清培养基中的终浓度为100U/mL，所述链霉素在每升无血清培养基中的终浓度为100U/mL。本专利技术还提供了所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，在鲤鱼三倍体细胞培养中的应用。所述鲤鱼三倍体细胞培养方法如下：1)原代细胞的培养：采用组织块贴壁法对三倍体鲤鱼细胞进行原代细胞的培养；2)传代细胞培养法：长满单层后进行传代培养，用胰蛋白酶消化液消化细胞系，弃掉消化液，加入完全培养液，将细胞吹散成单个后继续培养，细胞贴壁后换液去除死细胞，长满单层后继续传代培养；3)无血清培养基培养：传代至鲤鱼三倍体细胞性状稳定，将细胞置于无血清培养基中培养。进一步地限定，步骤1)所述组织贴壁法对三倍体鲤鱼细胞进行原代细胞的培养是指将三倍体鲤鱼尾鳍组织经灭菌后，23℃倒置培养12h，然后加入完全培养液正置培养。进一步地限定，步骤2)所述胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶质量分数为0.25％，消化时间为2min。进一步地限定，步骤3)中鲤鱼三倍体细胞培养是置于细胞板中，每个孔中接种细胞1x105个，加入2.5ml无血清培养基，23℃培养，每天换液。有益效果1)无血清培养基是未来细胞培养的趋势，本专利技术无血清细胞培养添加剂的使用，添加剂成分确定，使用安全性高，全合成配方，无批间差异，培养条件容易保持一致，保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。2)该培养基配方制作简便，成本低，降低了细胞培养的成本。3)可以提高鲤鱼三倍体细胞原代培养的贴壁率，促进细胞生长，缩短传代时间，提高细胞得率。采用本专利技术所述的无血清培养基培养鲤鱼三倍体细胞，能够满足三倍体细胞生长需要，保持快速的生长和增殖特性，2～3天传代一次，三倍体细胞健康良好生长，得到数量更多，纯度更高的细胞。本培养基对细胞的生长无毒、无抑制作用，不影响细胞的生长和功能的表达，具有安全稳定的优点。附图说明图1鲤鱼二倍体和三倍体红细胞直径与体积，a为鲤鱼二倍体细胞，b为鲤鱼三倍体细胞。图2鲤鱼二倍体、三倍体细胞染色体中期分裂相，左为二倍体鲤鱼细胞，右为三倍体鲤鱼细胞。图3鲤鱼三倍体与二倍体的细胞核DNA含量，横坐标为DNA相对含量，单位为ng/ul，纵坐标为细胞数目，鸡红细胞为对照。图4完全培养基培养第4天的鲤鱼三倍体细胞(×400)H.E.染色。图5无血清培养基培养第4天的鲤鱼三倍体细胞(×400)H.E.染色。图6不同培养基培养下的鲤鱼三倍体细胞的生长曲线。具体实施方式所述完全培养基：DMEM培养基中添加质量含量为10％的胎牛血清、10mmol/L的HEPES、100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，所述浓度均为终浓度。调节PH至7.4，0.22μm微孔滤膜除菌，4℃冷藏备用。所述基础培养基组：DMEM培养基中添加10mmol/L的HEPES、100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，所述浓度均为终浓度。调节PH至7.4，0.22μm微孔滤膜除菌，4℃冷藏备用。所述DMEM基础培养基为低糖基础培养基，购买自GIBCO。下述实施例所用到的二倍体鲤体细胞和三倍体鲤体细胞取自本实验室细胞培养中心。本专利技术所述的所有药品均购自GIBCO。实施例1.适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基。本实施例所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，由DMEM低糖基础培养基、抗生素和培养添加剂组成，每升无血清培养基中培养添加剂的含量如下表1所示：表1无血清培养基中的培养添加剂含量所述抗生素为青霉素和链霉素，每升无血清培养基中青霉素的终浓度为100U/mL，链霉素的终浓度为100U/mL。所述适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基的配制方法如下：(1)将本专利技术无血清培养基用的培养添加剂，各成分按剂量置于容器中，向容器中加入约300毫升蒸馏水，于室温下混合溶解，再加入适量的蒸馏水，混合均匀后待用；(2)将100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，加入到(1)步骤的溶液中，充分混匀，直至全部溶解，加入DMEM基础培养基干粉，所述DMEM培养基购买自GIBCO，按照产品使用说明书定容至1000mL，用质量分数为5.6％的NaHCO3调节PH至7.4，然后经0.22μm微孔滤膜除菌，4℃冷藏备用。实施例2.适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基。重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例所述的无血清培养基配方中的培养添加剂的含量如下表2所示：表2无血清培养基中的培养添加剂含量编号添加剂成分终含量1重组人胰岛素样生长因子-1(Insulin-likedGrowthFactor-1)0.35μg2重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bF本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子‑1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4‑羟乙基哌嗪乙磺酸。
【技术特征摘要】
1.一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子-1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸。2.根据权利要求1所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基由DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素组成，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.21-0.35μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.24-0.33μg、血小板源性生长因子0.20-0.27μg、牛血清白蛋白4.71-5.90mg、牛转铁蛋白6.30-7.51mg、纤粘连蛋白0.81-1.32mg、非必需氨基酸1.90-2.51mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.303-2.402g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。3.根据权利要求2所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，其特征在于，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.30μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.30μg、血小板源性生长因子0.22μg、牛血清白蛋白5.3mg、牛转...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛淑群，黄金善，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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