一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，涉及微生物技术领域，包括以下步骤：A：采集、B：分离、C：筛选、D：复筛、E：统计、F：制备以及G：注射，本发明专利技术根据放线菌的抑菌特性，制成能够注入植物体内的抑菌溶液，显著提升了植物炭疽菌拮抗作用，较目前病害防治所用的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染和不易产生抗药性的特征。本发明专利技术制成的抑菌溶液，能够对多种病原菌进行抑制，在被开发为生防菌制剂用于对植物病害的生物防治上，具有良好的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法
本专利技术涉及微生物
，特别涉及一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法。
技术介绍
植物内生菌是一类新的生防微生物资源，它是一种能在植物组织中定殖与运转，并对植物无害甚至有益的微生物。由于它在植物体内有稳定的生存空间，且能产生与宿主植物代谢相同或相似的生理活性物质，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。内生菌分布于宿主植物组织内部，比暴露于外部环境的附生菌具有更稳定的生存环境，更易于发挥作用。加之，植物内生放线菌具有一定的宿主专一性，除从其宿主植物吸取养料和对侵染宿主植物的其它生物起作用外，对宿主植物本身及其它生物几乎没有影响，而且内生放线菌可以通过人工接种被导入不同的植物并可以通过植物种子进行遗传。因此植物内生菌具有作为生物农药开发的优良特性。目前，对农作物病害的防治主要以化学防治为主，众所周知，化学农药的长期大量使用往往会导致环境污染、农药残留及病原菌的抗药性等诸多问题难以解决。利用植物内生菌产生的抗菌活性物质进行植物病害的生物防治，则具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等优点。因此，专利技术一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法来解决上述问题很有必要。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，解决了现有的问题。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，包括以下步骤：A：采集：取一定量的太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶，以及一定量从太子参及茶叶主产区采集的土壤；B：分离：首先从太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶分离出炭疽病原菌，然后从太子参及茶叶主产区采集的土壤样品中分离出多株细菌；C：筛选：从多株细菌中筛选出多株具有拮抗炭疽病原菌的细菌菌株，然后通过平板划线法在培养基中将菌株纯化，对纯化后的细菌菌株进行复筛，并在同一个培养皿中做3-5次重复，得到复筛后的细菌菌株；D：复筛：通过扩增细菌的16-SrDNA序列，将测序回来的序列经NCBI同源比对后，构建系统进化树，然后将细菌经过革兰氏染色和芽孢染色，再通过全自动微生物分析系统对多种细菌进行生理生化指标测定，将其分为不同的种属，然后通过压片镜检法来筛选出放线菌；E：统计：将含有炭疽病原菌菌落分别放入不同的培养基中(含不同种类的放线菌菌株)，培养4-6小时后，统计多种细菌菌株对炭疽病原菌的菌丝生长抑制率，得到拮抗效果最好的放线菌菌株，将其命名为菌株A1103；F：制备：首先将菌株A1103放入培养基中活化，时间为2-4天，然后将活化后的菌株A1103接种到高氏一号液体发酵培养基，取发酵液经由无菌滤纸抽滤，分别获得上清液和菌丝体，取上清液，用乙酸乙酯萃取1-3次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液，菌丝体用60-80％的丙酮水溶液浸泡，浸泡时间为8-12小时，然后用超声波破碎提取2-4次，合并提取液，将提取液减压浓缩至无丙酮后，得到菌株A1103的粗提取液，G：注射：将所得粗提物以无菌水稀释配制成溶液，注入植物的体内。可选的，所述步骤B中炭疽病原菌和细菌的分离方法均为土壤稀释分离法。可选的，所述步骤C中筛选的方法为平板对峙法。可选的，所述步骤C中的培养基位高氏合成1号固体培养基，不含琼脂。可选的，所述步骤C中的培养时间为6-8天，培养温度为26-30℃。可选的，所述步骤D中全自动微生物分析系统的型号为VITEK2COMPACT型全自动微生物鉴定系统。可选的，所述步骤E中的培养基为加热熔化的液体PDA培养基，培养条件为25-27℃。可选的，所述步骤E中采用十字交叉测量菌落直径，计算菌落直径平均值和菌丝生长抑制率，菌丝生长抑制率计算公式如下：菌丝生长抑制率(％)＝[1-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100。可选的，所述步骤F中的培养基为PDA斜面培养基，培养条件为28-30℃恒温培养箱。可选的，所述步骤G中溶液的浓度为200-600mg/L。(三)有益效果本专利技术提供了一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，具备以下有益效果：(1)、本专利技术根据放线菌的抑菌特性，制成能够注入植物体内的抑菌溶液，显著提升了植物炭疽菌拮抗作用，较目前病害防治所用的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染和不易产生抗药性的特征。(2)、本专利技术制成的抑菌溶液，能够对多种病原菌进行抑制，在被开发为生防菌制剂用于对植物病害的生物防治上，具有良好的市场应用前景。(3)、本专利技术工艺简单，设备要求低，可操作性强，具有良好的社会推广应用。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，包括以下步骤：A：采集：取一定量的太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶，以及一定量从太子参及茶叶主产区采集的土壤；B：分离：首先根据土壤稀释分离法从太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶分离出炭疽病原菌，然后根据土壤稀释分离法从太子参及茶叶主产区采集的土壤样品中分离出多株细菌；C：筛选：根据平板对峙法从多株细菌中筛选出多株具有拮抗炭疽病原菌的细菌菌株，然后通过平板划线法在培养基中将菌株纯化，培养基为高氏合成1号固体培养基，不含琼脂，培养时间为6天，培养温度为26℃，然后对纯化后的细菌菌株进行复筛，并在同一个培养皿中做3次重复，得到复筛后的细菌菌株；D：复筛：通过扩增细菌的16-SrDNA序列，将测序回来的序列经NCBI同源比对后，构建系统进化树，然后将细菌经过革兰氏染色和芽孢染色，再通过VITEK2COMPACT型全自动微生物鉴定系统对多种细菌进行生理生化指标测定，将其分为不同的种属，然后通过压片镜检法来筛选出放线菌；E：统计：将含有炭疽病原菌菌落分别放入不同的培养基中(含不同种类的放线菌菌株)，培养基为加热熔化的液体PDA培养基，培养条件为25℃，培养4小时后，统计多种细菌菌株对炭疽病原菌的菌丝生长抑制率，得到拮抗效果最好的放线菌菌株，将其命名为菌株A1103，采用十字交叉测量菌落直径，计算菌落直径平均值和菌丝生长抑制率，菌丝生长抑制率计算公式如下：菌丝生长抑制率(％)＝[1-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100；F：制备：首先将菌株A1103放入培养基中活化，培养基为PDA斜面培养基，培养条件为28℃恒温培养箱，时间为2天，然后将活化后的菌株A1103接种到高氏一号液体发酵培养基，取发酵液经由无菌滤纸抽滤，分别获得上清液和菌丝体，取上清液，用乙酸乙酯萃取1次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液，菌丝体用60％的丙酮水溶液浸泡，浸泡时间为8小时，然后用超声波破碎提取2次，合并提取液，将提取液减压浓缩至无丙酮后，得到菌株A1103的粗提取液，G：注射：将所得粗提物以无菌水稀释配制成溶液，溶液的浓度为200mg/L，注入植物的体内。实施例2：一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，包括以下步骤：A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：A：采集：取一定量的太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶，以及一定量从太子参及茶叶主产区采集的土壤；B：分离：首先从太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶分离出炭疽病原菌，然后从太子参及茶叶主产区采集的土壤样品中分离出多株细菌；C：筛选：从多株细菌中筛选出多株具有拮抗炭疽病原菌的细菌菌株，然后通过平板划线法在培养基中将菌株纯化，对纯化后的细菌菌株进行复筛，并在同一个培养皿中做3‑5次重复，得到复筛后的细菌菌株；D：复筛：通过扩增细菌的16‑SrDNA序列，将测序回来的序列经NCBI同源比对后，构建系统进化树，然后将细菌经过革兰氏染色和芽孢染色，再通过全自动微生物分析系统对多种细菌进行生理生化指标测定，将其分为不同的种属，然后通过压片镜检法来筛选出放线菌；E：统计：将含有炭疽病原菌菌落分别放入不同的培养基中(含不同种类的放线菌菌株)，培养4‑6小时后，统计多种细菌菌株对炭疽病原菌的菌丝生长抑制率，得到拮抗效果最好的放线菌菌株，将其命名为菌株A 1103；F：制备：首先将菌株A 1103放入培养基中活化，时间为2‑4天，然后将活化后的菌株A 1103接种到高氏一号液体发酵培养基，取发酵液经由无菌滤纸抽滤，分别获得上清液和菌丝体，取上清液，用乙酸乙酯萃取1‑3次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液，菌丝体用60‑80％的丙酮水溶液浸泡，浸泡时间为8‑12小时，然后用超声波破碎提取2‑4次，合并提取液，将提取液减压浓缩至无丙酮后，得到菌株A 1103的粗提取液，G：注射：将所得粗提物以无菌水稀释配制成溶液，注入植物的体内。...

【技术特征摘要】
1.一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：A：采集：取一定量的太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶，以及一定量从太子参及茶叶主产区采集的土壤；B：分离：首先从太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶分离出炭疽病原菌，然后从太子参及茶叶主产区采集的土壤样品中分离出多株细菌；C：筛选：从多株细菌中筛选出多株具有拮抗炭疽病原菌的细菌菌株，然后通过平板划线法在培养基中将菌株纯化，对纯化后的细菌菌株进行复筛，并在同一个培养皿中做3-5次重复，得到复筛后的细菌菌株；D：复筛：通过扩增细菌的16-SrDNA序列，将测序回来的序列经NCBI同源比对后，构建系统进化树，然后将细菌经过革兰氏染色和芽孢染色，再通过全自动微生物分析系统对多种细菌进行生理生化指标测定，将其分为不同的种属，然后通过压片镜检法来筛选出放线菌；E：统计：将含有炭疽病原菌菌落分别放入不同的培养基中(含不同种类的放线菌菌株)，培养4-6小时后，统计多种细菌菌株对炭疽病原菌的菌丝生长抑制率，得到拮抗效果最好的放线菌菌株，将其命名为菌株A1103；F：制备：首先将菌株A1103放入培养基中活化，时间为2-4天，然后将活化后的菌株A1103接种到高氏一号液体发酵培养基，取发酵液经由无菌滤纸抽滤，分别获得上清液和菌丝体，取上清液，用乙酸乙酯萃取1-3次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液，菌丝体用60-80％的丙酮水溶液浸泡，浸泡时间为8-12小时，然后用超声波破碎提取2-4次，合并提取液，将提取液减压浓缩至无丙酮后，得到菌株A1103的粗提取液，G：注射：将所得粗提物以无菌水稀释配制成溶液，注入植物的体内。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈美霞，刘伟，彭成彬，柯栋贤，甘鹏，
申请(专利权)人：宁德师范学院，
类型：发明
国别省市：福建,35