一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法技术

本发明专利技术涉及检验医学技术领域，具体公开了一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法。该方法在染色体芯片得到拷贝数重复片段基础信息后，靶向捕获断裂位点可能所在大致区域的序列，通过成熟的生物信息学分析未知来源的序列以判断其定位。不需要获得基因组上其他不相关区域的序列信息，就能富集包含断裂位点的基因序列并构建文库进行高通量测序，从而更加高效、快速、低成本地分析得到临床意义未知的拷贝数增加的具体断裂位点以及定位信息。本发明专利技术将对拷贝数变异相关疾病的遗传诊断和咨询起到重要的作用。

A Method for Detecting Fragmentation Sites and Location Information of Chromosome Repeated Fragments

The invention relates to the technical field of laboratory medicine, in particular to a method for detecting chromosome repeat fragment breaking sites and location information. After obtaining the basic information of duplicate fragments on chromosome chips, this method aims to capture the sequence of the probable region of the break site, and then uses mature bioinformatics to analyze the sequence of unknown sources to determine its location. Without obtaining sequence information of other unrelated regions in the genome, we can enrich gene sequences containing break sites and construct a library for high-throughput sequencing, so as to obtain specific break sites and location information with unknown copies of clinical significance increasing more efficiently, quickly and cheaply. The invention will play an important role in genetic diagnosis and consultation of diseases related to copy number variation.

【技术实现步骤摘要】
一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法
本专利技术涉及检验医学
，具体地说，是一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法。
技术介绍
拷贝数变异是与人类遗传病相关的一种重要的基因组变异，已经被证明与许多遗传病特别是神经发育相关疾病相关。以往针对拷贝数变异的检测技术包括染色体核型，荧光原位杂交(FISH)、荧光定量PCR(Q-PCR)和染色体芯片等。染色体芯片分析技术又被称为“分子核型分析”，能够在全基因组水平进行扫描，可检测染色体不平衡的拷贝数变异。染色体芯片检测周期快、通量高、成本合理，被认为是目前针对拷贝数变异的检测中，最适用于临床患者检测的技术，但目前以后的检测技术包括染色体芯片，都是定量或半定量的检测，对拷贝数变异的分析不够全面。临床检测中所有检测到的拷贝数变异都应进行分类和判读，对于拷贝数缺失，根据染色体芯片的结果可以明确缺失基因的数量和断裂位点的具体位置，从而针对性地进行致病机制分析，为判断拷贝数缺失的致病性提供依据。相较于拷贝数缺失，拷贝数重复与临床表型的关系更难解释，因为拷贝数增加可能是串联重复(tandemduplication)或是插入重复(dispersedduplication)，而染色体芯片的局限性在于仅根据探针杂交信号提供的拷贝数变异结果不能确定其断裂位点，更无法判断拷贝数增加片段可能插入基因组的位置和影响的基因，因此许多的拷贝数变异被分类为“临床意义未知的拷贝数重复”，目前临床上还没有一种可应用于检测拷贝数增加断裂位点和定位信息的技术，以帮助判断这些拷贝数重复的致病性。目前已经被广泛接受的mate-pair和跳跃文库(jumpinglibrary)等高通量测序文库构建技术，已经可以成功地检测全基因组范围内的平衡性染色体结构变异，但这些技术仍然存在一些严重的缺陷，如步骤繁琐、成本较高，起始DNA需要量大，不利于常规应用。近年来高通量测序技术(next-generationsequencing，NGS)的发展，为我们进一步研究这些原来无法明确解释的拷贝数变异提供了新的途径。所以，基于高通量测序技术建立一套用于检测拷贝数重复片段断裂位点和定位信息，帮助临床判断拷贝数重复致病性的检测技术，对于拷贝数变异检测的临床诊断应用有着重要的意义。
技术实现思路
现有的染色体拷贝数重复的致病性较难评估，目前的检测技术均无法检测拷贝数重复片段的断裂位点和定位信息，从而无法分类为串联重复或插入重复，评估染色体重复片段对染色体上其他基因的影响及重复片段的致病性。本专利技术基于高通量测序技术，开发了一种靶向捕获建库技术，用于特异性扩增拷贝数重复断裂位点附近区域的序列，在获得测序数据后通过生物信息学分析得到拷贝数重复片段的所在位置，可帮助临床更加准确地判断拷贝数重复片段的致病性，提高患者的诊断效率。本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，在染色体芯片分析得到拷贝数重复片段基础信息后，设计靶向捕获引物，特异性扩增拷贝数重复断裂位点附近区域的序列，靶向捕获断裂位点可能所在大致区域的序列，富集包含断裂位点的基因序列并构建文库进行高通量测序，通过生物信息学分析得到拷贝数重复片段的所在位置。在上述方法中，作为一个优选方案，包括如下步骤：(1)准备通用接头；通用接头序列1：5’pCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGGCG*T通用接头序列2：5’CGCCAGGTTCCAGTCA3’(2)设计断裂位点区域特异性引物；(3)锚定引物靶向捕获；a.利用超声破碎仪CovarisS220对样本进行处理，使基因组DNA在处理后最大片段峰值为1200bp；b.末端修复和加A尾；c.连接通用接头；d.第一轮锚定巢式PCR；e.第二轮引物巢式PCR；f.混合所有锚定PCR产物作为捕获区域扩增子；g.将混合后的PCR产物破碎至适合文库构建的大小；(4)对捕获的扩增子进行建库并测序，通过下游生物信息学分析得到断裂位点的具体位置和附近序列信息。在上述方法中，作为一个优选方案，所述断裂位点区域特异性引物设计包括如下步骤：(1)：根据染色体芯片检测结果，导出断裂位点可能所在区域染色体坐标；(2)：利用Primer3设计区域特异性引物，避开与测序平台接头序列冲突的序列；(3)：利用BLAT将区域特异性引物和全基因组进行匹配，确保引物的特异性；(4)：对两轮巢式PCR的区域特异性引物进行检查，保证相邻的引物不会互相影响；(5)：检查所有引物3’端12个碱基的特异性。在上述方法中，作为一个优选方案，所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息方法具体如下：(1)准备通用接头通用接头序列1：5’pCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGGCG*T通用接头序列2：5’CGCCAGGTTCCAGTCA3’通用接头序列1和2同时稀释到100pmol/L浓度，在一个PCR反应管分别加入50ul去离子水，以及100pmol/L的通用接头序列1和2各25ul；95℃2分钟，取出放置室温20分钟后，-20℃保存；(2)设计断裂位点区域特异性引物根据染色体芯片检测结果，导出断裂位点可能所在区域染色体坐标；利用Primer3设计区域特异性引物，避开与测序平台接头序列冲突的序列；利用BLAT将区域特异性引物和全基因组进行匹配，确保引物的特异性；对两轮巢式PCR的区域特异性引物进行检查，保证相邻的引物不会互相影响；检查所有引物3’端12个碱基的特异性；(3)锚定引物靶向捕获a.利用超声破碎仪对样本进行处理，使基因组DNA在处理后最大片段峰值为1200bp；AgencourtAMPureXP磁珠纯化破碎到适当长度的样本DNA，洗脱体积为27ul；b.末端修复和加A尾末端修复：破碎并纯化后DNA25ul，NEBEndRepairBuffer10ul，NEBEndRepairEnzymemix5ul，水60ul，总量为100ul；20℃30分钟后取出，AgencourtAMPureXP磁珠纯化，洗脱体积为22ul；加A尾：末端修复并纯化后DNA20ul，NEBdAtailingBuffer5ul，Klenow3ul，水22ul，总量50ul；37℃30分钟后取出，AgencourtAMPureXP磁珠纯化，洗脱体积为53ul；Nanodrop定量纯化后样本作为质控，如起始样本量为2ug，此时纯化后浓度约为20ng/ul；c.连接通用接头上步中纯化后样本50ul，10XLigationBuffer10ul,通用接头0.5ul，T4DNALigase5ul，水34.5ul，总量为100ul；混匀后室温1小时，QiagenPCRpurificationkit纯化，洗脱体积为23ul；d.第一轮锚定巢式PCR反应体系为25ul；10XHighFidelityPCRBuffer2.5ul，50mgMgSO41ul，10mMdNTP0.5ul，PCR1引物0.5ul，锚定引物0.5ul，模板1ul，TaqDNAPolymeraseHighFidelity0.1ul，水18.9ul；PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，在染色体芯片分析得到拷贝数重复片段基础信息后，设计靶向捕获引物，特异性扩增拷贝数重复断裂位点附近区域的序列，靶向捕获断裂位点可能所在大致区域的序列，富集包含断裂位点的基因序列并构建文库进行高通量测序，通过生物信息学分析得到拷贝数重复片段的所在位置。

【技术特征摘要】
1.一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，在染色体芯片分析得到拷贝数重复片段基础信息后，设计靶向捕获引物，特异性扩增拷贝数重复断裂位点附近区域的序列，靶向捕获断裂位点可能所在大致区域的序列，富集包含断裂位点的基因序列并构建文库进行高通量测序，通过生物信息学分析得到拷贝数重复片段的所在位置。2.根据权利要求1所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)准备通用接头；通用接头序列1：5’pCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGGCG*T通用接头序列2：5’CGCCAGGTTCCAGTCA3’(2)设计断裂位点区域特异性引物；(3)锚定引物靶向捕获；a.利用超声破碎仪对样本进行处理，使基因组DNA在处理后最大片段峰值为1200bp；b.末端修复和加A尾；c.连接通用接头；d.第一轮锚定巢式PCR；e.第二轮引物巢式PCR；f.混合所有锚定PCR产物作为捕获区域扩增子；g.将混合后的PCR产物破碎至适合文库构建的大小；(4)对捕获的扩增子进行建库并测序，通过下游生物信息学分析得到断裂位点的具体位置和附近序列信息。3.根据权利要求2所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，所述断裂位点区域特异性引物设计包括如下步骤：(1)：根据染色体芯片检测结果，导出断裂位点可能所在区域染色体坐标；(2)：利用Primer3设计区域特异性引物，避开与测序平台接头序列冲突的序列；(3)：利用BLAT将区域特异性引物和全基因组进行匹配，确保引物的特异性；(4)：对两轮巢式PCR的区域特异性引物进行检查，保证相邻的引物不会互相影响；(5)：检查所有引物3’端12个碱基的特异性。4.根据权利要求2所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，具体方法如下：(1)准备通用接头通用接头序列1：5’pCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGGCG*T通用接头序列2：5’CGCCAGGTTCCAGTCA3’通用接头序列1和2同时稀释到100pmol/L浓度，在一个PCR反应管分别加入50ul去离子水，以及100pmol/L的通用接头序列1和2各25ul；95℃2分钟，取出放置室温20分钟后，-20℃保存；(2)设计断裂位点区域特异性引物根据染色体芯片检测结果，导出断裂位点可能所在区域染色体坐标；利用Primer3设计区域特异性引物，避开与测序平台接头序列冲突的序列；利用BLAT将区域特异性引物和全基因组进行匹配，确保引物的特异性；对两轮巢式PCR的区域特异性引物进行检查，保证相邻的引物不会互相影响；检查所有引物3’端12个碱基的特异性；(3)锚定引物靶向捕获a.利用超声破碎仪对样本进行处理，使基因组DNA在处理后最大片段峰值为1200bp；AgencourtAMPureXP磁珠纯化破碎到适当长度的样本DNA，洗脱体积为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚如恩，王剑，郁婷婷，沈亦平，李国强，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：上海,31