一种γ-氨基丁酸含量的测定方法技术

本发明专利技术提供了一种高效液相色谱检测γ‑氨基丁酸的方法，属于产品质量检验领域。具体方案如下：采用Sepax HP‑SCX柱，以0.2 M的磷酸盐缓冲溶液（pH 2.5‑3.5）为流动相，紫外检测器在210nm分别检测γ‑氨基丁酸样品标准品与样品溶液的峰面积，并计算样品含量。本发明专利技术的方法克服了传统方法中衍生化试剂易被氧化，衍生物不稳定，随着时间的推移，峰面积极不稳定等缺点，具有回收率、重现性好，精密度高，专属性较强等优点。而且检测物出峰时间短，适合大量高纯度γ‑氨基丁酸样品检验。

A Method for Determining the Content of Gamma-Aminobutyric Acid

The invention provides a method for detecting gamma aminobutyric acid by high performance liquid chromatography, which belongs to the field of product quality inspection. The specific scheme is as follows: Sepax HP SCX column was used, 0.2 M phosphate buffer solution (pH 2.5 3.5) was used as mobile phase, and ultraviolet detector was used to detect the peak area of standard and sample solution of gamma aminobutyric acid samples at 210 nm, respectively, and the sample content was calculated. The method of the invention overcomes the shortcomings of the traditional method that the derivative reagent is easy to be oxidized, the derivative is unstable, and the peak area is extremely unstable over time. It has the advantages of good recovery, good reproducibility, high precision and strong specificity. Moreover, the peak time of the detection is short, which is suitable for the detection of a large number of high purity gamma aminobutyric acid samples.

【技术实现步骤摘要】
一种γ-氨基丁酸含量的测定方法
本专利技术属于产品质量检验领域，具体涉及一种γ-氨基丁酸含量的测定方法。
技术介绍
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)，又称氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，分布非常广泛，在动物、植物和微生物中均有GABA存在。随着研究深入，GABA的生理功能不断得到阐明，已发展成为一种新型功能性因子，具有抗压、促睡眠、祛皱、保湿、美白等功效，正逐渐被广泛用于医药、食品保健、化工及农业等行业，在中国、美国、日本等地被批准为公认安全食品，具有较高的开发利用前景。目前对γ-氨基丁酸的测定主要采用高效液相色谱法，因γ-氨基丁酸无紫外吸收且酸性极强，需经过柱前衍生过程才能检测，所用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、2,4-二硝基氟苯(FDNB)、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)。由于与邻苯二甲醛衍生法步骤简单、反应快速、过量试剂不干扰结果，2010年版中国药典中采用γ-氨基丁酸与邻苯二甲醛衍生进行定量，生成具有较强荧光和紫外吸收的异吲哚衍生物，采用C18柱将其分离出来。由于衍生物极易被氧化，随着时间的推移，峰面积极不稳定，尤其是在长时间大量样品检测的过程中，将直接影响测定结果的准确性和重现性。PITC衍生法所得衍生物稳定，但需在无水条件下进行，容易影响分析柱使用寿命；FDNB衍生法能得到较为稳定的衍生物，但是反应副产物会干扰检测结果。因此，需要寻找一种不需要衍生剂检测γ-氨基丁酸含量的方法。
技术实现思路
针对目前高效液相色谱法检测γ-氨基丁酸含量均需要衍生剂，影响结果准确性和重现性的问题，本专利技术提供一种γ-氨基丁酸的检测方法，回收率、重现性好，精密度高，检测时间短。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种高效液相色谱检测γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：（1）配制标准品溶液：精密称取γ-氨基丁酸标准品，用流动相溶解、定容配制成标准品溶液；（2）配制样品溶液：精密称取γ-氨基丁酸样品，用流动相溶解、定容配制成样品溶液；（3）色谱条件：色谱柱：SepaxHP-SCX；流动相：0.2M的磷酸盐缓冲溶液，pH2.5-3.5；流速：0.5-1.2mL/min；检测波长：210nm；（4）含量计算：样品中γ-氨基丁酸的的含量按下式计算：式中：X1——样品中γ-氨基丁酸的含量；Ai——样品中γ-氨基丁酸的峰面积；mS——γ-氨基丁酸标准品的质量（g）；C——γ-氨基丁酸标准品纯度（%）；AS——γ-氨基丁酸标准品的峰面积；m——称取样品的质量（g）。所述样品γ-氨基丁酸可以是化学合成法获得的，也可以是生物合成法获得的。优选的，样品中γ-氨基丁酸的含量为20-99.9%；更优选为80%-99%。作为优选，步骤（1）中还包括标准品溶液配制成系列浓度标准品溶液的步骤；相应的，步骤（4）中含量计算为：根据系列浓度标准品溶液计算γ-氨基丁酸浓度-峰面积的标准回归曲线y=a+bx，其中，y为γ-氨基丁酸的峰面积，x为γ-氨基丁酸浓度（g/L）；根据γ-氨基丁酸样品的峰面积计算样品中γ-氨基丁酸浓度与含量（%）。所述流动相的溶质为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾和磷酸或盐酸。上述检测方法中，0.01g/L的γ-氨基丁酸的理论峰面积应不低于200。优选的，步骤（1）和步骤（2）中，溶液过滤膜过滤。所述滤膜的孔径为0.22-0.45μm。步骤（3）中，进样量为10-25μL。本专利技术具有以下优点：本专利技术采用离子交换柱，克服了传统方法中衍生化试剂易被氧化，衍生物不稳定，随着时间的推移，峰面积极不稳定等缺点，具有回收率、重现性好，精密度高，专属性较强等优点。而且检测物出峰时间短，适合大量高纯度γ-氨基丁酸样品检验。附图说明图1为实施例1中γ-氨基丁酸标准品（0.5g/L）的谱图；图2为实施例1中γ-氨基丁酸样品的谱图；图3为实施例3中添加谷氨酸的γ-氨基丁酸样品的谱图；图4为实施例3中添加吡咯烷酮的γ-氨基丁酸样品的谱图；图5为实施例3中检测方法的线性范围。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1γ-氨基丁酸含量检测（1）配置标准品溶液：精密称取γ-氨基丁酸标准品适量，用流动相配制成0.5024g/L的溶液，0.45μm滤膜过滤后，作为标准品溶液；（2）配制样品溶液：精密称取生物合成法获得的样品0.5020g，用流动相溶解转入100mL容量瓶中以流动相定容，作为样品溶液；（3）色谱条件：色谱柱：SepaxHP-SCX（4.6×250mm）；柱温：30℃；流动相：0.2M的磷酸缓冲溶液，pH3.0；流速：0.8mL/min；进样量10μL；检测波长：210nm；（4）含量计算：样品中氨基丁酸的的含量按下式计算：式中：X1——样品中γ-氨基丁酸的含量；Ai——样品中γ-氨基丁酸的峰面积；mS——γ-氨基丁酸标准品的质量（g）；C——γ-氨基丁酸标准品纯度（%）；AS——γ-氨基丁酸标准品的峰面积；m——称取样品的质量（g）；计算结果保留小数点后一位有效数字。将同一样品连续检测10次，根据峰面积计算得出γ-氨基丁酸的含量。结果见表1：表1γ-氨基丁酸含量测定结果从表1可以看出氨基丁酸含量的测定结果比较稳定，没有明显的波动或者下降趋势。实施例2γ-氨基丁酸含量检测参照实施例1中的步骤测定另一样品，不同在于步骤（2）中精密称取样品1.027g，用流动相溶解转入100mL容量瓶中以流动相定容，作为样品溶液。将同一样品连续检测10次，根据峰面积计算得出γ-氨基丁酸的含量。结果见表2：表2γ-氨基丁酸含量测定结果从表2可以看出低含量的氨基丁酸的测定结果也比较稳定，没有明显的波动或者下降趋势。实施例3方法验证（1）专属性配制浓度为约0.5g/L的谷氨酸标准溶液。精密量取谷氨酸标准溶液和实施例1中标准品溶液各600μL混合成混合液（1:1）。取实施例1中同一样品溶液、上述谷氨酸溶液和混合液，用高压液相色谱按实施例1中所述色谱条件测定，结果如图3所示，其中，a为谷氨酸，b为γ-氨基丁酸，c为谷氨酸和γ-氨基丁酸的混合；其分离度R=2(tR2-tR1)/(Y1+Y2)=2(6.955-0.651)/(0.1133+0.1089)=3.906.其中，tR表示保留时间，Y表示峰宽，R大于1.5才算是完全分开，结果显示R=3.906，能够完全将谷氨酸与γ-氨基丁酸分离，符合检测要求。配制浓度为约0.5g/L的吡咯烷酮标准溶液。精密量取吡咯烷酮标准溶液和实施例1中标准品溶液各600μL混合成混合液（1:1）。取实施例1中同一样品溶液、上述吡咯烷酮溶液和混合液，用高压液相色谱按实施例1中所述色谱条件测定，不同在于，流速为1mL/min；结果如图4所示，其中，a为γ-氨基丁酸，b为吡咯烷酮，c为γ-氨基丁酸与吡咯烷酮的混合；其分离度R=2(tR2-tR1)/(Y1+Y2)=2(5.906-5.135)/(0.1067+0.1034)=7.34.其中，tR表示保留时间，Y表示峰宽，R大于1.5才算是完全分开，结果显示R=7.34，能够完全将吡咯烷酮与γ-氨基丁酸分离，符合检测要求。（2）线性关系精密称取8gγ-氨基丁酸标准品置1L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效液相色谱检测γ‑氨基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制标准品溶液：精密称取γ‑氨基丁酸标准品，用流动相溶解、定容配制成标准品溶液；（2）配制样品溶液：精密称取γ‑氨基丁酸样品，用流动相溶解、定容配制成样品溶液；（3）色谱条件：色谱柱：Sepax HP‑SCX；流动相：0.2 M的磷酸盐缓冲溶液，pH 2.5‑3.5；流速：0.5‑1.2mL/min；检测波长：210nm；（4）含量计算：样品中γ‑氨基丁酸的的含量按下式计算：

【技术特征摘要】
1.一种高效液相色谱检测γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制标准品溶液：精密称取γ-氨基丁酸标准品，用流动相溶解、定容配制成标准品溶液；（2）配制样品溶液：精密称取γ-氨基丁酸样品，用流动相溶解、定容配制成样品溶液；（3）色谱条件：色谱柱：SepaxHP-SCX；流动相：0.2M的磷酸盐缓冲溶液，pH2.5-3.5；流速：0.5-1.2mL/min；检测波长：210nm；（4）含量计算：样品中γ-氨基丁酸的的含量按下式计算：式中：X1——样品中γ-氨基丁酸的含量；Ai——样品中γ-氨基丁酸的峰面积；mS——γ-氨基丁酸标准品的质量（g）；C——γ-氨基丁酸标准品纯度（%）；AS——γ-氨基丁酸标准品的峰面积；m——称取样品的质量（g）。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中还包括标准品溶液配制成系列浓度标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆震，张天萌，钱晓璐，杨旭，郭文逸，陈玉娟，石艳丽，郭学平，
申请(专利权)人：华熙福瑞达生物医药有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37