基于中红外光谱快速鉴定和检测原肌球蛋白的方法技术

本发明专利技术属于检测领域，提供一种基于中红外光谱技术的水产品中主要过敏原原肌球蛋白快速鉴定与检测方法，通过获得被测样品的中红外谱图，并经过二阶求导，比对原肌球蛋白的红外谱图特征峰和被测样品的红外谱图，实现原肌球蛋白的快速定性鉴别和定量检测。本发明专利技术无需抗体即可实现原肌球蛋白的快速检测，还能达到快速定性鉴别和定量检测目的，同时实现无损食品要求。

【技术实现步骤摘要】
基于中红外光谱快速鉴定和检测原肌球蛋白的方法
本专利技术属于生物鉴定领域，涉及水产品中主要过敏原原肌球蛋白的鉴定和检测方法，具体涉及基于中红外光谱技术的过敏原原肌球蛋白快速鉴定方法，用于快速鉴定和检测甲壳类和贝类中的过敏原原肌球蛋白。
技术介绍
水产品中，虾蟹(甲壳)类和贝类为水产品的主要致敏食物，而原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)是其中最主要的过敏原，其引起的过敏症状日趋复杂和严重；而传统的烹饪手段并不能降解原肌球蛋白，所以此类水产品经常引起食物过敏事件，因此十分有必要探索出快速鉴别和检测过敏原原肌球蛋白的方法。目前的过敏原原肌球蛋白检测技术主要包括三类。第一类是分子生物学方法，以检测编码过敏原DNA片段的聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术为代表；第二类是免疫学方法，以检测过敏原性的酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)为代表；第三类是仪器分析法，以分析全蛋白或酶解后肤段氨基酸序列的质谱技术和基于表面等离子体共振的生物传感器为代表。申请号CN201711037844.3的专利文件公开了一种基于抗体技术的近场光波靶向传感器检测甲壳类过敏原的方法，利用近场光波靶向传感器采集和检测荧光强度变化进行检测；申请号CN201510711292.4的专利文件公开了一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，先后采用了质谱技术与竞争性ELISA检测法；申请号201410231103.9的专利文件公开了一种检测水产类过敏原的胶体金试纸条，由载体板、硝酸纤维膜等组成；申请号201010521189.0的专利文件公开了一种快速检测原肌球蛋白的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备，用磁信号仪定量检测原肌球蛋白能达到0.15μg/mL。上述的检测方法中，质谱技术的仪器成本高、操作要求高，并且用SDS电泳分离蛋白导致蛋白变性或者需要经酶切分别对肽段进行检测分析，对被检食品样品有损害；PCR检测技术用来检测加工食品可能出现假阴性结果；免疫学检测技术基于抗原抗体结合反应，然而抗体制备困难，耗时长；胶体金试纸条样品检测耗时长，且所需抗体制备困难；磁性免疫层析方法及检测试纸条的前处理方法繁杂，耗时长且同样需要抗体；生物传感器的检测方法步骤繁琐且同样需要抗体。因此，需要对现有方法加以改进，获得一种准确性和特异性高、不破坏原有样品，且所述样品量较少的检测鉴定方法，实现快速、准确地对水产品中过敏原原肌球蛋白的检测。中红外光谱技术是指分子能选择性吸收某些波长的红外线，而引起分子中振动能级和转动能级的跃迁。检测红外线被吸收的情况可得到物质的红外吸收光谱，通过比对标准样品的红外谱图的特征峰以及待测样品的红外谱图，可完成样品的快速鉴定与检测。现有研究中，采用红外检测分析研究蛋白质的二级结构，但目前还没有采用红外光谱对蛋白质进行检测或鉴定的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种基于中红外光谱快速鉴定与检测原肌球蛋白的方法。本专利技术技术方案为，一种基于中红外光谱快速鉴定和检测原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从待测样品中获取原肌球蛋白，进行红外光谱测定，得到一级中红外谱图数据；(2)所获得的一级中红外谱图经过二阶求导，在二阶导数的红外图谱中寻找是否存在原肌球蛋白的特征峰，从而判断样品中是否含有原肌球蛋白，并进一步判断样品中是否有来源于贝类或者虾类的原肌球蛋白。所述待测样品源自虾类水产品、虾类水产品制品或者含有虾类水产品时，所述的特征峰包括1662±1cm-1、1562cm-1,1551±1cm-1、1363±1cm-1、1314±2cm-1和1240±1cm-1；待测样品源自蟹类水产品、蟹类水产品制品或者含有蟹类水产品时，特征峰包括1699cm-1,1688±1cm-1,1683cm-1,1674cm-1,1667±1cm-1,1657cm-1,1651cm-1,1647cm-1,1637cm-1,1630cm-1,1618±1cm-1,1611cm-1,1563cm-1,1557cm-1,1553cm-1,1367cm-1,1347cm-1,1302cm-1,1247cm-1,1147cm-1和1099cm-1；待测样品源自贝类水产品、贝类水产品制品或者含有贝类水产品时，特征峰包括1580cm-1、1570±1cm-1、1548±1cm-1、1363±1cm-1和1297±2cm-1。所述的虾类水产品为南美白对虾、草虾、基围虾、明虾和皮皮虾中的至少一种；所述的蟹类水产品为石蟹和梭子蟹中的至少一种；所述的贝类水产品为蛤蜊、蛏子、螺蛳、扇贝和贻贝中的至少一种。步骤(1)中，红外光谱测定扫描所获得的原始图谱经过基线校正、光谱平滑、光谱计算和归一化处理的预处理操作，得到一级中红外图谱，经二阶求导后，得到二阶导数图谱。红外光谱测定的扫描范围选自4000～400cm-1区间内，光谱分辨率为2～6cm-1；扫描次数为15～20次，取平均光谱。本专利技术的优选实施方式为：使用ATR单点法，测试温度为20-25℃，湿度为45％以内，光谱分辨率为4cm-1，测量范围在4000～400cm-1，图谱分析选取1800-1000cm-1的范围，扫描次数为16次。步骤(2)中，在二阶导数图谱中寻找是否存在用于鉴定蛋白质的一组红外特征峰，以确定样品为蛋白质。所述用于鉴定蛋白质的一组红外特征峰包括：1693±1cm-1、1688cm-1、1678cm-1、1646cm-1、1513cm-1。所述过敏原原肌球蛋白的特征峰通过以下方法获得：(a)收集不同来源虾类、蟹类、贝类的原肌球蛋白样品和非原肌球蛋白样品，测定中红外谱图；(b)所获得的中红外谱图经过二阶求导，在二阶导数的红外图谱中找出原肌球蛋白与非原肌球蛋白的差异峰；(c)分析不同来源原肌球蛋白二阶导数的红外图谱，分析虾类、蟹类、贝类水产品中原肌球蛋白共有的特征峰。例如，同属虾类的水产品原肌球蛋白中，具有一组共同的特征峰：1662±1cm-1、1562cm-1,1551±1cm-1、1363±1cm-1、1314±2cm-1和1240±1cm-1；同属蟹类的水产品原肌球蛋白中，具有一组共同的特征峰：1699cm-1,1688±1cm-1,1683cm-1,1674cm-1,1667±1cm-1,1657cm-1,1651cm-1,1647cm-1,1637cm-1,1630cm-1,1618±1cm-1,1611cm-1,1563cm-1,1557cm-1,1553cm-1,1367cm-1,1347cm-1,1302cm-1,1247cm-1,1147cm-1和1099cm-1；同属贝类的水产品原肌球蛋白中，具有一组共同的特征峰：1580cm-1、1570±1cm-1、1548±1cm-1、1363±1cm-1和1297±2cm-1。提取原肌球蛋白的方法包括以下步骤：A.待测样品用丙酮抽提后，按1g：4～10mL比例加入pH＝9.0～9.4的Tris-HCl缓冲液，匀浆后低温离心得到原肌球蛋白粗提液；B.原肌球蛋白粗提液经过沉淀法富集其中的原肌球蛋白，并且经过纯化，冷冻干燥，得到原肌球蛋白冻干粉。上述方法还可以用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于中红外光谱快速鉴定和检测水产品中主要过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从待测样品中获取原肌球蛋白，进行红外光谱测定，得到一级中红外谱图数据；(2)所获得的一级中红外谱图经过二阶求导，在二阶导数的红外图谱中寻找是否存在原肌球蛋白的特征峰，从而判断样品中是否含有原肌球蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种基于中红外光谱快速鉴定和检测水产品中主要过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从待测样品中获取原肌球蛋白，进行红外光谱测定，得到一级中红外谱图数据；(2)所获得的一级中红外谱图经过二阶求导，在二阶导数的红外图谱中寻找是否存在原肌球蛋白的特征峰，从而判断样品中是否含有原肌球蛋白。2.权利要求1所述基于中红外光谱快速鉴定和检测水产品中主要过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，所述原肌球蛋白的特征峰通过以下方法获得：(a)收集不同来源虾类、蟹类、贝类的原肌球蛋白样品和非原肌球蛋白样品，测定一级中红外谱图；(b)所获得的一级中红外谱图经过二阶求导，在二阶导数图谱中找出原肌球蛋白与非原肌球蛋白的差异峰；(c)分析不同来源原肌球蛋白的二阶导数图谱，分析虾类、蟹类、贝类水产品中原肌球蛋白共有的特征峰。3.权利要求1所述基于中红外光谱快速鉴定和检测水产品中主要过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，所述待测样品源自虾类水产品、虾类水产品制品或者含有虾类水产品时，其特征峰包括1662±1cm-1、1562cm-1,1551±1cm-1、1363±1cm-1、1314±2cm-1和1240±1cm-1；待测样品源自蟹类水产品、蟹类水产品制品或者含有蟹类水产品时，其特征峰包括1699cm-1,1688±1cm-1,1683cm-1,1674cm-1,1667±1cm-1,1657cm-1,1651cm-1,1647cm-1,1637cm-1,1630cm-1,1618±1cm-1,1611cm-1,1563cm-1,1557cm-1,1553cm-1,1367cm-1,1347cm-1,1302cm-1,1247cm-1,1147cm-1和1099cm-1；待测样品源自贝类水产品、贝类水产品制品或者含有贝...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢瑛，李娅茹，许长华，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31