一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物技术

本发明专利技术公开了一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物，所述的方法可用于筛选多态性好、稳定性高的EST‑SSR分子标记引物，进而后续对该属植物进行群体遗传和适应进化方面的研究。本发明专利技术在胡桃属物种转录组数据分析过程中，设计开发的EST‑SSR多态性微卫星位点并从开发的33‑77对EST‑SSR引物中筛选出12‑39对多态性好且稳定性高的EST‑SSR引物，条带清晰、能100％扩增，可靠性强，只需常规PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管测序仪即可完成对该分子标记的快速筛选。开发的双亲遗传且与基因功能相关的EST‑SSR分子标记，可作为胡桃属群体遗传多样性和适应进化研究的引物，可为进一步遗传图谱构建、基因定位及分子辅助育种等研究提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物
本专利技术属于植物分子生物
，涉及一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物。
技术介绍
EST-SSR是基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记，与基因组SSR相比，EST-SSR具有在植物物种之间可转移性的优点。目前，EST-SSR被广泛应用于植物基因组学研究如遗传图谱构建、比较作图、遗传多样性评价、种质鉴定、系统发育与进化研究等方面。传统基因组SSR标记开发费时、费力、且成本较高，需要投入大量的人力物力。而基于转录组数据，通过搜索SSR的EST-SSR标记开发具有稳定性高、通用性好、成本低、开发简单快捷等特点而备受关注。因为一些转录组微卫星标记可以转移到一些相关分类中，他们可以被有效用于群体进化分析、群体遗传研究和比较定位中，EST-SSRs数据不仅可开发功能，RNA-seq对于罕见转录本、多样化拼接和细胞中基因表达水平都有潜在的恢复作用，此外，采用高通量测序的方法对胡桃属物种丰富的遗传资源进行EST-SSR分子标记的开发筛选及遗传多样性研究，有利于特异资源的挖掘、分子标记辅助育种提供技术指导，有助于理解植物进化与适应。另外，在转录组数据分析的基础上开发EST-SSR引物，从中筛选多态性高、稳定性好的标记，这对胡桃属物种种质资源的保护具有重要的意义。在引物开发方面，虽然胡桃属物种已开展一些基于分子标记的遗传研究，但主要是采用SSR、RAPD、ISSR、AFLP标记技术进行遗传多样性和品种鉴别等方面的研究(陈少瑜等2006，2011)，尤其在GenBank中有关于泡核桃的基因组资源只有17条核苷酸序列和181个蛋白序列。在泡核桃基因组DNA中并未出现微卫星位点的资料记载，所有关于泡核桃的研究(Wangetal.2015；Gunnetal.2010)受到了可利用的多态性标记数目及不存在可利用的ESTs(expressedsequencetags)标签的限制。尤其是通过转录组测序，表达功能基因注释等技术，进行泡核桃特异EST-SSR引物的开发还很有限，目前国内外均未见文献报道。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷和不足，本专利技术给出了一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物，解决了现有技术中缺乏快速筛选胡桃属植物EST-SSR分子标记方法的问题。同时得到了引物，该引物的扩增稳定性和多态性良好。为解决上述问题，本专利技术采取的技术方案为：一种胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物，所述引物的正向引物序列为F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列为R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，对待筛选的植物进行RNA提取，所述的RNA进行denovo测序后得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到多态性微卫星位点目标引物；所述的数据处理包括：(1)将EST-SSR根据引物PCR扩增产物片段大小进行降序排列，并将未设计引物的EST-SSR数据删除；(2)再根据碱基重复类型进行EST-SSR降序排列后，将碱基重复类型为单碱基重复且碱基重复次数小于18的EST-SSR删除；(3)根据EST-SSR碱基重复单元总数进行降序排列，删除碱基重复单元总数小于60的序列；(4)根据EST-SSR引物PCR扩增产物片段大小进行升序排列，删除扩增产物片段大小在140bp以下并且碱基重复单元总数小于20的引物序列；(5)根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，删除碱基重复单元总数小于18的引物序列；(6)然后根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，再删除碱基重复类型为Pc的碱基序列；(7)依次以引物PCR扩增产物大小和碱基重复单元总数对EST-SSR进行降序排列，保留总序列数目中的位于前50％的引物序列为初筛序列；(8)在初筛序列中选取产物片段长度为142-280bp的引物；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度段均保证对应五对引物，通过PCR扩增筛选即得多态性EST-SSR引物。可选的，对胡桃属植物的叶片、芽和/或果实进行RNA的提取，对所述的RNA进行denovo测序后得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到胡桃属多态性微卫星位点目标引物。可选的，利用IlluminaHiseq对提取得到的RNA进行高通量测序后得到原始reads，原始reads经如下处理后得到cleanreads；再对cleanreads进行denovo组装，得到转录本序列；(1)去除不确定碱基比例占总碱基数的5％以上的reads；(2)去除质量值Q≤10的碱基数达整条序列20％以上的reads；(3)去除含测序接头的reads。可选的，使用Trinity对得到的cleanreads进行denovo组装，得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes；通过MISA脚本http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html对Unigenes进行微卫星位点识别。可选的，所述的引物设计采用http://primer3.sourceforge.net/releases.php设计引物，然后进行设计得到的引物的多态性扩增；控制产物片段长度为142-280bp；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度均保证对应五对引物；即得EST-SSR引物；引物设计参数：核苷酸长度为18bp-23bp，扩增产物大小为142-280bp，最适退火温度为58℃，GC含量为50％-60％。一种引物，所述的引物采用本专利技术所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法筛选得到。本专利技术的有益效果：(1)从大量的序列中快速筛选目标引物。(2)本方法筛选的分子标记特异性极高，稳定性极强，只需要常规PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色显色步骤即可完成对引物多态性及稳定性的鉴定，为胡桃属及其他物种的辅助育种提供理论和技术上的支持。附图说明图1为实施例一中的PCR扩增条件；各引物退火温度见表1；图2为泡核桃(J.sigillata)EST-SSR引物PCR扩增的泡核桃聚丙烯凝胶电泳图谱，(a)表示引物JS5720对泡核桃48个个体PCR扩增产物图谱；M为DNAMarker扩增的DNA标准分子量(bp)(b)为引物JS6809对泡核桃48个个体PCR扩增产物图谱；M为DNAMarker扩增的DNA标准分子量(bp)；图3为核桃(J.regia)43个个体引物JR6508PCR扩增产物聚丙烯凝胶电泳图谱；M为DNAMarker扩增的DNA标准分子量(bp)；图4为麻核桃(J.hopeiensis)38个个体引物JH42753PCR扩增产物聚丙烯凝胶电泳图谱；M为DNAMarker扩增的DNA标准分子量(bp)；图5为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物，其特征在于，所述引物的正向引物序列为F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列为R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。

【技术特征摘要】
1.一种胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物，其特征在于，所述引物的正向引物序列为F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列为R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。2.一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，对待筛选的植物进行RNA提取，所述的RNA进行denovo测序后得到转录本序列，然后将每个转录本序列聚类分析结果最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到多态性微卫星位点目标引物；所述的数据处理包括：(1)将EST-SSR根据引物PCR扩增产物片段大小进行降序排列，并将未设计引物的EST-SSR数据删除；(2)再根据碱基重复类型进行EST-SSR降序排列后，将碱基重复类型为单碱基重复且碱基重复次数小于18的EST-SSR删除；(3)根据EST-SSR碱基重复单元总数进行降序排列，删除碱基重复单元总数小于60的序列；(4)根据EST-SSR引物PCR扩增产物片段大小进行升序排列，删除扩增产物片段大小在140bp以下并且碱基重复单元总数小于20的引物序列；(5)根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，删除碱基重复单元总数小于18的引物序列；(6)然后根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，再删除碱基重复类型为Pc的碱基序列；(7)依次以引物PCR扩增产物大小和碱基重复单元总数对EST-SSR进行降序排列，保留总序列数目中的位于前50％的引物序列为初筛序列；(8)在初筛序列中选取产物片段长度为142-280bp的引物；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度段均保证对应五对引物，通过PCR扩增筛选即得多态性EST-SSR引物。3.根据权利要求2所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，对胡桃属植物的叶片、芽和/或果实进行RNA的提取，对所述的RNA进行denovo...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文清，解孝满，赵鹏，王磊，袁晓莺，仝伯强，刘鵾，
申请(专利权)人：西北大学，山东省林木种质资源中心，
类型：发明
国别省市：陕西,61