两步基因组比较法设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法技术

本发明专利技术公开了一种两步基因组比较法设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法。本发明专利技术首先将NJAU 4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，再将筛选得到的片段与同种菌株916的全基因组比对，设计出系列具独特碱基的引物序列。同时，还选用gfp标记菌株gfp‑NJAU 4742中插入的标记片段设计的三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准。通过同属不同种菌株扩增特异性检验、土壤添加再检测、盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出最优的定量PCR引物。本发明专利技术的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和贵州木霉NJAU 4742的定量提供方法。

【技术实现步骤摘要】
两步基因组比较法设计贵州木霉NJAU4742定量PCR特异性引物的方法
本专利技术属于农业微生物领域，涉及对一株贵州木霉NJAU4742的定量PCR技术的特异性引物的设计及应用。
技术介绍
在过去的十几年中，对目标植物有利生长的研究中已经将大量功能性微生物菌剂直接接种到土壤中或与有机肥料结合作为土壤改良剂。因此，接种菌株在新环境中的存活在其功能表现上起着关键作用，因为有效的定殖是功能菌株刺激植物生长或对土壤微生物生态系统有利诱导的根本前提。传统上选择性培养基多被用于检测或分离环境中的有益促生菌，然而，该方法灵敏度较低且耗时，并且对于形态上相似度极高的真菌种难以准确识别。基于DNA分析，定量PCR(qPCR)技术可以准确定量土壤中多种微生物的丰度，已成为当前分子生物学及微生物生态学研究和应用中使用最多的技术之一，其方法利用引物组定量扩增一段不含任何副产物(非特异性DNA)的特异DNA片段的拷贝，因此引物设计是qPCR中至关重要的一环。目前常用的引物设计必须首先寻找到具有特异性的序列(通常的做法是，从文献中获取物种特异性基因，并根据其保守的范围确定其通用性)，然而，从文献中获得的所谓“物种特异性基因”往往信息比较滞后，并未基于不断增长的基因组数据进行必要的更新，导致基于该基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其特异性。有研究者基于木霉属共有的内部转录组间隔区(ITS)对木霉菌属设计引物且在不同的土壤中进行检测和定量；然而，这对于木霉种的区分是不够特异的。也有研究者利用SCAR标记技术能够对物种进行准确鉴定和监测，然而此分子方法基于对RAPD序列的分析，这是十分费时费力的过程。木霉菌属的真菌在土壤中广泛存在，被认为是一种理想的生物防治剂，具有特定的生物防治机制，包括产生抗生素，具有竞争及诱导抗性等。同时，一些具有根际定殖能力的木霉菌株通过增加养分吸收以及刺激植物防御生物和非生物损害为植物生长提供直接或间接的促进作用。贵州木霉属于哈茨木霉菌种的亚种，贵州木霉NJAU4742在国内已被广泛应用于商业生物制剂的固体发酵和生物肥料开发(专利申请号200910233576.1，CN201610003589.X和CN201610440785.3)。该菌株具有较强的促进植物生长的能力并含有多种优势基因。因此，探索来自功能性菌株贵州木霉4742的新型产品的开发以及通过定量PCR技术监测其在植物根系的动态变化，揭示其在农业生产实践的潜在促生机制尤为重要。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有实时定量PCR特异性引物设计技术的局限，提供一种两步比较基因组法，基于真菌特异性片段设计菌株特异性定量PCR引物的方法；并利用两步比较基因组法设计了贵州木霉NJAU4742的菌株特异性定量PCR引物。一种两步基因组比较设计贵州木霉NJAU4742定量PCR特异性引物的方法；包括如下步骤：(1)将NJAU4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，(2)将筛选得到的片段与同胞菌株916全基因组一一比对，得到一系列具体区分菌株916的独特碱基序列作为NJAU4742全基因组引物序列设计的来源，利用Oligo6软件实施引物序列设计，设定产物大小为100-200bp，引物长度为22±2bp，共设计10对引物，同时，选用由农杆菌介导的gfp标记菌株gfp-NJAU4742中插入的单拷贝片段按照上述参数设计三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准；另选用一对已报道哈茨木霉引物作为对照；(3)选用gfp标记菌株gfp-NJAU4742中的单拷贝片段设计的三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准，再通过与同属不同种菌株依次交叉扩增特异性检验、土壤添加扩增特异性再检测、盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出如下两对最优的贵州木霉NJAU4742定量PCR引物；P6：上游引物如SEQIDNO.11所示和下游引物如SEQIDNO.12所示；P7：上游引物如SEQIDNO.13所示和下游引物如SEQIDNO.14所示。gfp标记菌株gfp-NJAU4742的构建方法如下：通过农杆菌介导转化方法，将质粒pCAMBIA-gfp中T-DNA插入至NJAU4742基因组中，获得成功标记且稳定遗传的木霉gfp-NJAU4742菌株，并通过southernblotting实验验证其插入片段为单拷贝。最后，结合Biolog分析与病原真菌的平板对峙试验结果显示了荧光标记菌株具有与野生型相同的表型特征及重寄生能力，具体见已发表论文(JianZhang,GunseliBayramAkcapinar,LeaAtanasova,MohammadJavadRahimi,AgnieszkaPrzylucka,DongqingYang,ChristianP.Kubicek,RuifuZhang,QirongShen,IrinaS.Druzhinina.TheneutralmetallopeptidaseNMP1ofTrichodermaguizhouenseisrequiredformycotrophyandself-defence.EnvironmentalMicrobiology,2016,18(2),580–597)。按照上述的方法设计的贵州木霉NJAU4742定量PCR特异性引物，选自P6和P7中的任意一对；P6：上游引物如SEQIDNO.11所示和下游引物如SEQIDNO.12所示；P7：上游引物如SEQIDNO.13所示和下游引物如SEQIDNO.14所示。本专利技术所述的贵州木霉NJAU4742定量PCR特异性引物在制备贵州木霉NJAU4742定量PCR试剂盒中的应用。本专利技术所述的贵州木霉NJAU4742定量PCR特异性引物在贵州木霉NJAU4742定量和/或定性检测中的应用。有益效果本专利技术的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和贵州木霉NJAU4742的定量提供方法，该方法设计的两对引物用于贵州木霉NJAU4742的定量特异性好、准确度高。附图说明图1基于贵州木霉NJAU4742基因组设计的10对引物对不同木霉种菌株的交叉扩增。条带M,DL2000DNA标记；条带1,贵州木霉NJAU4742；2,T.lixii2784(TUCIMNO.)；3,贵州木霉3009；4,贵州木霉1044；5,贵州木霉4843；6,哈茨木霉1818；7,贵州木霉3611；8,贵州木霉1651；9,贵州木霉53；10,哈茨木霉916；11,T.atrobrunneum271；12,Hypocrea'pseudoharzianum'nom.prov.2610；13,T.afroharzianum51；14,Hypocrea'pseudoharzianum'nom.prov.2710and15,T.pyrimidale2673。引物ITS1作为阳性对照.图2使用M13通用引物对14个克隆质粒的普通PCR扩增验证图3不同土壤类型及添加木霉属相近菌株处理对贵州木霉gfp-NJAU4742定量效果的影响。图中字母代表基于图基检验下的不同引物检测拷贝的显著性。图4土壤中接种贵州木霉NJAU4742不同孢子浓度梯度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种两步基因组比较设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法；其特征在于包括如下步骤：(1)将NJAU 4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，(2)将筛选得到的片段与同胞菌株916全基因组一一比对，得到一系列具体区分菌株916的独特碱基序列作为NJAU 4742全基因组引物序列设计的来源，利用Oligo 6软件实施引物序列设计，设定产物大小为100‑200bp，引物长度为22±2bp，共设计10对引物，；同时，选用由农杆菌介导的gfp标记菌株gfp‑NJAU 4742中插入的单拷贝片段按照上述参数设计三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准；另选用一对已报道哈茨木霉引物作为对照；(3)选用gfp标记菌株gfp‑NJAU 4742中的单拷贝片段设计的三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准，再通过与同属不同种菌株依次交叉扩增特异性检验、土壤添加扩增特异性再检测、盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出如下两对最优的贵州木霉NJAU 4742定量PCR引物；P6：上游引物如SEQ ID NO.11所示和下游引物如SEQ ID NO.12所示；P7：上游引物如SEQ ID NO.13所示和下游引物如SEQ ID NO.14所示。...

【技术特征摘要】
1.一种两步基因组比较设计贵州木霉NJAU4742定量PCR特异性引物的方法；其特征在于包括如下步骤：(1)将NJAU4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，(2)将筛选得到的片段与同胞菌株916全基因组一一比对，得到一系列具体区分菌株916的独特碱基序列作为NJAU4742全基因组引物序列设计的来源，利用Oligo6软件实施引物序列设计，设定产物大小为100-200bp，引物长度为22±2bp，共设计10对引物，；同时，选用由农杆菌介导的gfp标记菌株gfp-NJAU4742中插入的单拷贝片段按照上述参数设计三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准；另选用一对已报道哈茨木霉引物作为对照；(3)选用gfp标记菌株gfp-NJAU4742中的单拷贝片段设计的三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准，再通过与同属不同种菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈其荣，张杨，李荣，蔡枫，张建，庞冠，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京农业大学淮安研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32