一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌(Methanoculleus)的酶切方法，该方法包含以下步骤：(1)将窖泥中含量最高的30个优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列分别进行MAFFT比对，找出各属的代表性序列2‑4个；(2)各属代表性序列的酶切分析，从中找出来甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式3‑10种；(3)在全部30个优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列中逐一验证上述3‑10种特征性酶切方式。(4)经过确认的特征性酶切方式再进行实验验证。(5)最终确认至少一种甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式用于窖泥厌氧培养过程中菌落的快速鉴定。本发明专利技术可达到从窖泥厌氧菌群中快速识别甲烷囊菌属细菌的目的，比起常规测序鉴定节省大量时间。

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法
本专利技术属于生物
，涉及一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法，该方法原则上可以找出若干经济方便的针对16SrDNA全长序列的限制性内切酶方案，用于把甲烷囊菌属细菌与窖泥中其他菌属的厌氧培养菌落区分开来。实际应用时与每次都进行菌落测序相比可以节约大量的时间。
技术介绍
窖泥中含有丰富的微生物菌群，其中厌氧菌和兼性厌氧菌占大多数。根据实验室既有的高通量测序数据显示，Aminobacterium，Clostridium，Methanoculleus，Sedimentibacter，Syntrophomonas五个属的微生物含量在古井窖泥微生物菌群结构中排名前五。并已知Aminobacterium(胺杆菌属)，Methanoculleus(甲烷囊菌属)，Sedimentibacterr(瘤胃球菌属)是窖泥中的优质菌属，研究表明它们能够改善浓香型大曲酒的风味，提升酒产品的质量。所以研究这些菌属的培养条件、鉴定方法，提高它们在窖泥微生物群落中的含量，对酒产品质量的提升具有重要意义。对窖泥厌氧菌的培养实验证明Methanoculleus的细菌较难培养获得，因为严格的绝对厌氧是甲烷细菌的主要特征之一。甲烷囊菌属作为窖泥中的优质菌属，研究其各种生物学特征是有意义的，而这些工作的前提是要培养鉴定出甲烷囊菌属细菌。目前窖泥中微生物的种属主要通过16SrDNA测序来鉴定，包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因。目前已知甲烷囊菌对白酒发酵很重要，但是很难得到纯的甲烷囊菌，原因之一是没有从窖泥厌氧菌落中快速鉴定甲烷囊菌的方法。利用16SrDNA限制性酶切分析法从窖泥厌氧菌落中快速鉴定甲烷囊菌就是本专利要解决的科学技术问题。利用酶切鉴定甲烷囊菌的工作目前还未有报道，本专利设计的酶切方案能够快速地从窖泥中菌群的厌氧培养菌落中识别出甲烷囊菌，将来可以应用到窖泥中的甲烷囊菌属的鉴定工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速鉴定甲烷菌菌落的酶切方法。通过对窖泥中培养得到的厌氧菌的16SrDNA进行限制性酶切分析，使甲烷囊菌属细菌16S序列的酶切结果(酶切片段的数量和大小)区别于窖泥其他属细菌的酶切结果，这样就可达到从窖泥厌氧培养生长的菌落中快速识别甲烷囊菌属细菌的目的。利用扩增16SrDNA限制性酶切片段分析法对甲烷囊菌进行快速鉴定，选择甲烷囊菌属为目标属，开展限制性酶切片段分析鉴定的研究工作。本专利技术是通过以下技术方案来实现的：(1)优势菌属与甲烷囊菌属的16SrDNA全长序列分别进行MAFFT比对，找出各属代表性序列(2)各属代表性序列的酶切分析，找出甲烷囊菌16SrDNA全长序列的特征性酶切方式并在各个菌属逐一验证，确认至少一个甲烷囊菌特征性酶切方式；(3)通过具体实验验证种特征性酶切方式有效性，最终确认的至少一种甲烷囊菌16SrDNA全长序列的特征性酶切方式并用于窖泥厌氧培养过程中菌落的快速鉴定；具体实施方式1、窖泥菌群结构组成的测定及菌属核糖体RNA基因的全长DNA序列的获取可以使用核糖体高通量RNA基因的全长DNA测序获取含量最高的前30-50名菌属，并获取各自菌属的大量核糖体RNA基因的全长DNA序列；如果没有经过上述全长高通量测序，只是使用了核糖体基因可变区的高通量测序，仍然可以获得含量最高的30-50名菌属的名单，然后通过公共数据库下载对应菌属的核糖体RNA基因的全长DNA序列也可以。一般要求每个菌属随机下载至少100条核糖体RNA基因的全长DNA序列。2、利用MAFFT比对获取各个菌属的代表性序列MAFFT(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)网站可以进行多重序列的比对，把窖泥前30个优势菌属和甲烷囊菌属的所有16S全长序列按属分别输入到该网站中，比对结果显示属内序列产生分类，同类序列序列碱基排列方式相似，不同类序列之间碱基排列方式不同，从每类序列中找出最能代表此类序列碱基排列特征的序列，即代表性序列。MAFFT比对的最大优势是相似性越大的DNA序列在比对结果中越被摆放在越近的位置。利用这个特性可以对每个属的几十到几百条甚至更多的上述序列快速进行比对并直接挑选出来2-4条代表性序列。将甲烷囊菌属(Methanoculleus)及窖泥前30个优势菌属所有的16S全长序列进行MAFFT比对，最后根据比对结果各属分别找出了3条代表性序列。各属的代表性序列及属内序列总条数整理汇总如表1所示。对应的93条代表性序列见序列表。表1甲烷囊菌属和窖泥前30个优势菌属16S代表性序列汇总表3、上述代表性序列进行限制性内切酶图谱比较获取甲烷囊菌属的若干特征性酶切方案对上述代表性序列进行酶切图谱分析。首先把每条序列的0cutter即没有酶切位点的酶列举出来，做成交集。该交集中的限制性内切酶后面步骤中不予考虑。通过反复比较找出来至少一个甲烷囊菌属的特征性酶切方案，该方案理论上可以把甲烷囊菌与其他所有菌属区分开来。理论上一定可以找到若干个甚至很多个特征性酶切方案。确定手头上实际可用酶的范围，结果如表2所示.表2部分研究可用酶4、上述若干特征性酶切方案在全部菌属的核糖体RNA基因的全长DNA序列中的理论酶切测试对全部代表性序列进行限制性酶切位点分析。利用NEBcutter网站获得研究所用酶在代表性序列上的酶切位点图，找出各种酶在每个属代表性序列上的酶切位点个数及所在的位置。将优势菌属公共代表性序列的酶切位点图整理到一起，在甲烷囊菌属3条序列上的查找切割情况都相似的酶。这里各属代表性序列的酶切位点图以甲烷囊菌属为代表进行展示，该属代表性序列上的酶切位点如图1所示。5、经过验证的特征性酶切方案进行实验验证发现AcuI与XhoI两种酶符合要求(图2)。AcuI在3条序列上都有2个酶切位点且位置相近，同样XhoI在3条序列上都有3个酶切位点且位置相近，以这两种酶为对象进行接下去的研究。6、经过实验验证的酶切方案用于窖泥厌氧菌培养中菌落菌属的快速鉴定利用XhoI酶限制性酶切窖泥厌氧菌16SrDNA序列，再将酶切产物跑电泳。如果电泳结果出现4或5条亮带(含3或4个酶切位点)，那么就可确定其是甲烷囊菌序列，若只有1或2条亮带(含0或1个酶切位点)，那么就是非甲烷囊菌序列，而若有3条亮带(含2个酶切位点)，根据上述甲烷囊菌16S序列的2cutter酶切产物片段长度与其他属序列的2cutter酶切产物片段长度存在的明显差异，也可以将甲烷囊菌序列识别出来。技术优势1、本专利技术通过对窖泥中培养得到的厌氧菌的16SrDNA进行限制性酶切分析，使甲烷囊菌属细菌16S序列的酶切结果(酶切片段的数量和大小)区别于窖泥其他属细菌的酶切结果，这样可达到从窖泥厌氧菌群中快速识别甲烷囊菌属细菌的目的。将其利用到实际鉴定工作中，能够快速地将甲烷囊菌属细菌从窖泥厌氧菌群识别区分出来，比起每次都测序鉴定将节省大量的时间。2、本专利技术所提供的鉴定方法有助于培养鉴定出甲烷囊菌属细菌，得到较难通过实验方法获得纯的Methanoculleus(甲烷囊菌属)细菌，作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌(Methanoculleus)的酶切方法，该方法包含以下步骤：(1)优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列分别进行MAFFT比对，找出各属代表性序列；(2)各属代表性序列的酶切分析，找出甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式3‑10种；(3)在全部30个优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列中逐一验证上述3‑10种甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式，确认至少一种特征性酶切方式；(4)经过确认的特征性酶切方式通过进行实验验证进一步确认；(5)最终确认的至少一种甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式用于窖泥厌氧培养过程中菌落的快速鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌(Methanoculleus)的酶切方法，该方法包含以下步骤：(1)优势菌属与甲烷囊菌属的16SrDNA全长序列分别进行MAFFT比对，找出各属代表性序列；(2)各属代表性序列的酶切分析，找出甲烷囊菌16SrDNA全长序列的特征性酶切方式3-10种；(3)在全部30个优势菌属与甲烷囊菌属的16SrDNA全长序列中逐一验证上述3-10种甲烷囊菌16SrDNA全长序列的特征性酶切方式，确认至少一种特征性酶切方式；(4)经过确认的特征性酶切方式通过进行实验验证进一步确认；(5)最终确认的至少一种甲烷囊菌16SrDNA全长序列的特征性酶切方式用于窖泥厌氧培养过程中菌落的快速鉴定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：找出各属代表性序列方法如下：选取窖泥前30个优势菌属(按各属已测出的菌种数量由大到小)与Methanoculleus属的16...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩倩，陈彬彬，张治洲，何宏魁，曹润洁，李安军，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学威海，
类型：发明
国别省市：山东,37