一种以菊糖为底物合成菊二糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种以菊糖为底物合成菊二糖的方法，属于基因工程技术领域。AcDFA‑IIIase作为一个双果糖酐水解酶能够催化其底物双果糖酐为菊二糖，此催化反应的最适pH是6.5和最适温度55℃。在这个条件下，AcDFA‑IIIase也能够催化菊糖，产物是双果糖酐和菊二糖。说明AcDFA‑IIIase具有连续催化菊糖的能力，即先转化菊糖为双果糖酐，然后双果糖酐进一步被转化为菊二糖。这种以廉价菊糖为底物合成菊二糖的方法为工业化生产菊二糖提供了极大的参考价值。

【技术实现步骤摘要】
一种以菊糖为底物合成菊二糖的方法
本专利技术涉及一种以菊糖为底物合成菊二糖的方法，属于基因工程

技术介绍
菊糖(inulin)，是果糖以β-2,1-糖酐键相连而成的直链多糖，在链的还原端有一个葡萄糖基，菊糖的分子式表示为GFn。其中G表示还原端的葡萄糖基，F代表果糖分子，n代表果糖单位数。菊糖的聚合度是2～60，分子量在3500～5000Da之间。菊糖可以提高植物的耐旱能力，还可以起到液泡渗透缓冲剂和低温保护剂的作用。这主要是由于植物菊糖主要分布在细胞液泡中，起到了调节渗透压的作用。菊糖这种果聚糖像淀粉这样的葡聚糖一样具有储能作用，广泛的存在于一些菊科植物中，如菊苣，菊芋，大丽花和牛蒡中。这些植物分布在很多国家。通常，菊糖的获取是从这些植物中提取获得。目前，提取技术成熟，因此，菊糖的价格廉价。菊糖作为一种膳食纤维，是一种低甜度、低热量糖，具有增值双歧杆菌、降低血糖血脂、增强人体免疫能力等功能，已实现广泛商业化应用。近年来，菊糖被用来加工合成双果糖酐III这种新型功能性糖已经成为菊糖加工的新方向。双果糖酐III有利于钙、镁、铁、镁、锌、铜等矿物质元素的吸收，促进骨骼的生长；能够促进肠道有益微生物群的生长繁殖、利尿、改善便秘、预防结肠癌；增进黄铜类物质的吸收，促进大豆黄素代谢过程，提高黄酮类物质的生物价值以及抗龋齿等作用。因此，目前双果糖酐III及其合成酶菊糖果糖转移酶是研究的热点。这条代谢路径中的菊糖、双果糖酐和果糖都是重要应用的功能性糖，因此，在路径上的菊二糖理论上应该也具有重要的价值。但是目前菊二糖的理化性质以及生理性质都是未知的，主要可能是因为其合成受限，市场上也没有菊二糖样品可获得。而有关酶法合成菊二糖的合成研究极少，只有三篇有关双果糖酐水解酶合成菊二糖的报道，其中只有一篇报道利用的是纯化出来的双果糖酐水解酶，其他两篇主要利用的是微生物全细胞而并没有分离纯化出双果糖酐水解酶。因此，对双果糖酐水解酶的研究可能是工业酶法获得菊二糖的一个重要途径。双果糖酐水解酶需要以昂贵的双果糖酐为底物，经济上不可行。如果能找到一种直接利用廉价的菊糖为底物合成菊二糖的方法，而过程中又不需要添加菊糖果糖转移酶先转化菊糖，则能更适合于工业生产菊二糖。目前的三篇双果糖酐水解酶报道中，缺陷在于没有对双果糖酐水解酶催化菊糖的能力做鉴定或鉴定结果是对应的双果糖酐水解酶不能催化菊糖。因此，发现一种同时具有双果糖酐水解酶和菊糖果糖转移酶活性的酶作为催化剂，以廉价的菊糖为底物合成菊二糖，对菊二糖的工业生产有着至关重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以菊糖为底物合成菊二糖的方法，所述方法是以菊糖为底物，以一种双果糖酐水解酶(AcDFA-IIIase)为催化剂，将底物与酶混合于缓冲液中，在45～60℃温度条件下下反应12～24h。在本专利技术的一种实施方式中，所述双果糖酐水解酶的氨基酸序列是SEQIDNO.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述双果糖酐水解酶可以采用如下方法来制备：将编码双果糖酐水解酶的基因连接到质粒载体pET-22b(+)，限制性内切位点采用的是NdeI和XhoI，将构建的pET-22b(+)-AcDFA-IIIase转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑选平板阳性单克隆进行发酵培养；在发酵后，离心获得菌体，重悬后超声破碎，镍离子亲和层析纯化和透析后得到AcDFA-IIIase。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液是pH5.5～7.0的磷酸钠缓冲液。在本专利技术的一种实施方式中，所述反应温度是45～60℃。在本专利技术的一种实施方式中，所述反应时间是12～24h。在本专利技术的一种实施方式中，所述底物的浓度是40～100gL-1。在本专利技术的一种实施方式中，所述AcDFA-IIIase的添加量为2～15Ug-1。本专利技术提供了一种以廉价的菊糖为底物合成菊二糖的方法，传统菊二糖合成都是利用菊糖果糖转移酶将菊糖先转化为双果糖酐，然后利用双果糖酐水解酶再将此双果糖酐转化为菊二糖。本专利技术用双果糖酐水解酶直接以菊糖为底物合成了菊二糖，过程中不需要添加菊糖果糖转移酶先转化菊糖。这一方法首次实现了菊糖直接合成菊二糖，产率为15％～30％。这一发现对于工业化制备菊二糖具有重要的研究价值。附图说明图1：AcDFA-IIIase催化双果糖酐合成菊二糖图2：AcDFA-IIIase催化菊糖合成双果糖酐和菊二糖图3：菊糖初始浓度对AcDFA-IIIase催化菊糖的影响具体实施方式实施例1:AcDFA-IIIase克隆表达纯化双果糖酐水解酶基因在NCBI中的编号为Achl_2895，基因全长为1338个核酐酸，见序列表中SEQIDNo:1。该基因所编译的蛋白质编号是ACL40859.1，共有445个氨基酸，见序列表中SEQIDNo:2。对来源于微生物ArthrobacterchlorophenolicusA6的一个双果糖酐水解酶的基因构建质粒命名为pET-22b(+)-AcDFA-IIIase，其克隆所用质粒载体是pET-22b(+)，克隆宿主胞是E.coliDH5α。基因片段两端的限制性内切位点采用的是NdeI和XhoI，C端添加了组氨酸标记，用于镍离子亲和色谱分离纯化实验用。将构建的pET-22b(+)-AcDFA-IIIase转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。在含有100μgmL-1氨节青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑阳性单克隆转化子于50μg/mL氨节青霉素的LB液体培养基培养，37℃、200rpm摇培过夜，后接入LB培养基37℃培养3～4h至OD值为0.6～0.8，降温至30℃，加入IPTG终浓度为0.6mM诱导6h，发酵液于4℃、l2000rpm离心30min取菌体。加入20mL缓冲液(50mMPBS，200mMNaCl，调节pH至6.5)充分重悬菌体，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间ls，停止时间2s，共计18min。将获得的破碎液进行低温高速离心，10000rpm离心40min，得粗酶液，用0.22μm微孔滤膜过滤备用。在4℃环境下利用恒流泵，向镍离子亲和层析柱里泵入去离子水冲洗柱子(约5倍柱体积)，然后用低盐浓度的缓冲液(500mmolL-1NaCl，50mMPBS调节pH至6.5)平衡柱子环境。将得到的过膜粗酶液加入到柱子中，先用含有低浓度咪唑的缓冲液(500mmolL-1NaCl，50mmolL-1咪唑，50mMPBS调节pH至6.5)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmolL-1NaCl，500mmolL-1咪唑，50mMPBS调节pH至6.5)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，并测定其酶活，获得目的蛋白。纯化后AcDFA-IIIase达到电泳纯。实施例2：AcDFA-IIIase水解双果糖酐产菊二糖AcDFA-IIIase连续催化菊糖过程中分两步实现，即此酶先转化菊糖为双果糖酐，然后由于此酶具有水解双果糖酐能力将会进一步转化双果糖酐为菊二糖。将10Ug-1纯化得到的AcDFA-IIIase与10gL-1底物双果糖酐以及50mMpH6.5的磷酸盐缓冲液在45～60℃条件下反应12小时，沸水浴10min终止反应。18000×g4℃离心20min后，反应液经过0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成菊二糖的方法，其特征在于，所述方法是以菊糖为底物，将底物、酶加入中水溶液中进行反应，以双果糖苷水解酶(AcDFA‑IIIase)为催化剂，在45～60℃温度条件下反应。

【技术特征摘要】
1.一种合成菊二糖的方法，其特征在于，所述方法是以菊糖为底物，将底物、酶加入中水溶液中进行反应，以双果糖苷水解酶(AcDFA-IIIase)为催化剂，在45～60℃温度条件下反应。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，AcDFA-IIIase具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，AcDFA-IIIase的制备方法如下：将来源于微生物ArthrobacterchlorophenolicusA6的编码双果糖酐水解酶的基因通过质粒在大肠杆菌中进行表达；以pET-22b(+)为表达载体，以大肠杆菌BL21...

【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，江波，郁书怀，张涛，朱莺莺，程园园，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32