体外检测脂多糖对红细胞变形能力影响的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片体外检测脂多糖对红细胞变形能力影响的方法及其应用。本发明专利技术基于微流控芯片可实现个体化检测脂多糖对红细胞变形能力的影响及用于改善红细胞变形能力创新药物的筛选；脂多糖对红细胞变形能力个体影响作为临床抗生素治疗脓毒血症用药指标参数及药物疗效检测应用；本发明专利技术发现过氧化氢酶含量、脂质过氧化物含量、超氧化物歧化酶活性、Na

The Method and Application of Detecting the Effect of Lipopolysaccharide on Erythrocyte Deformability in Vitro

The invention discloses a method for in vitro detecting the effect of lipopolysaccharide on red blood cell deformability based on a microfluidic chip and its application. The invention is based on a microfluidic chip, which can realize the individualized detection of the effect of lipopolysaccharide on erythrocyte deformability and the screening of innovative drugs for improving erythrocyte deformability; the individual effect of lipopolysaccharide on erythrocyte deformability is used as an index parameter of clinical antibiotics in treating sepsis and the detection and application of drug efficacy; Catalase content, lipid peroxide content, superoxide dismutase activity and Na were found.

【技术实现步骤摘要】
体外检测脂多糖对红细胞变形能力影响的方法及其应用
本专利技术涉及一种体外检测脂多糖对红细胞变形能力影响的方法及其应用。
技术介绍
脂多糖(LPS)是内毒素的主要化学成分，它存在于革兰氏阴性细菌细胞的细胞壁中。细菌死亡后细胞壁瓦解释放出内毒素。当致病菌侵入血液循环系统时，会产生毒素等代谢产物，引起全身急性感染，产生脓毒血症。脓毒症是临床危重疾病之一，其死亡率极高，具有发冷，发热，皮疹，关节痛，肠胃不适及肝脾肿大的特点。严重的病例往往伴有乳酸酸中毒和顽固性脓毒性休克或迁移性病变，继而迅速进展为多器官功能衰竭，最终导致死亡。随着研究的深入，已发现脓毒症患者存在全身性血流动力学和广泛的微循环紊乱。由于血液流变学的高敏感性，对于脓毒症患者的血流改善和监测具有重要意义。人血红细胞(RBCs)作为血液中最多的宿主细胞，在血液流变学，微循环灌注，氧运输以及全身代谢稳态中起着重要作用。红细胞表现出显著和特殊的变形能力，因为其直径约8微米大大超过约3微米的微毛细血管，它必须经过变形才能通过从而保证微循环的有效运行。一些报道表明红细胞变形性与败血症之间存在关联，并发现红细胞的结构和化学性质在脓毒血症中发生改变。临床上治疗脓毒血症大多使用抗生素，抗生素可诱导细菌瓦解释放内毒素，开始抗生素治疗后内毒素释放量在脓毒症和感染性休克发病机制中的作用重大。不同个体对内毒素的敏感性差异可能对患者产生即时的不利影响从而影响治疗的效果。到目前为止，测定RBCs变形性的方法主要包括微孔膜过滤、激光衍射法、微量吸吮法、原子力显微镜、光学镊子等。其中，微孔膜过滤和激光衍射法仅提供红细胞群体变形性能，而不是单个细胞的变形参数。微管吸吮法和原子力显微镜专用于测量单个细胞，然而其测量受到吞吐量的限制。而且，这种技术具有仪器昂贵，耗时，劳动和技术密集的缺点。另一方面，败血症患者的白细胞(WBCs)变形性参数也发生改变，已知用于测定RBC变形性的传统技术存在WBC的干扰，RBC洗涤程序和去除血浆棕黄层操作不足以完全去除白细胞，如果装置被白细胞阻塞，则所观察到的红细胞变形指数降低，导致错误地认为红细胞变形性降低。虽然已有研究提出了LPS体外对RBC变形性的作用，但系统深入的探讨LPS对体外红细胞的变形性个体化差异及原因，并且通过将红细胞的力学性质与生物化学指标参数，包括Na+-K+-ATPase活性，超氧化物歧化酶活性，谷胱甘肽过氧化物酶活性，过氧化氢酶活性，三磷酸腺苷含量，脂质过氧化物含量，血红蛋白含量以及膜蛋白骨架成分含量进行分析，找到主要影响的生化指标的研究还未报道，讨论了LPS诱导红细胞变形能力的变化，揭示了变化的原因及其临床意义。然而，据我们所知，至今不同个体的红细胞对LPS的敏感性差异尚未被揭，LPS体外诱导红细胞变形能力的个体依赖效应的原因尚不清楚。本技术希望通过将微流控芯片技术与生化指标测定二者相结合，找出重要的指标参数。通过对不同个体对LPS的敏感性差异进行分析，为临床用抗生素治疗脓毒血症的个体化用药提供理论支持，同时也为提高红细胞变形能力的创新药物研发提供新的筛选方法。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本申请通过将微流控芯片技术与生化指标测定二者相结合，找出重要的指标参数，为临床个体化治疗提供新的指标和理论支持，而且为提高红细胞变形能力的创新药物研发提供新的筛选方法。本专利技术的目的在于提供一种基于微流控芯片体外检测脂多糖对红细胞变形能力影响的方法及其应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测化学物质对红细胞变形能力影响的方法，将经化学物质处理后的红细胞样品加入到微流控芯片中，检测红细胞的移动速率，与未经化学物质处理的对照组进行比较，判定经化学物质处理后，红细胞变形能力是否发生变化，从而判断化学物质对红细胞变形能力的影响；该方法不用于疾病的诊断和治疗。进一步地，微流控芯片中含有若干个进样口和出样口，进样口与出样口之间连有微通道；微通道入口处有阻挡装置，防止非红细胞进入并堵塞微通道，微通道内为重复并列排列的三棱柱结构，三棱柱结构间隔为2.8～3.2μm，只允许红细胞变形通过；微通道中三棱柱结构的列数为10列以上。进一步地，所述阻挡装置为重复并列排列的圆柱结构，圆柱结构直径8～12μm，相邻圆柱结构间隙为8～12μm。进一步地，进样口和出样口的直径为1.2～1.7mm。进一步地，红细胞样品加入到微流控芯片之前，对红细胞进行荧光染色，染色的红细胞加入到微流控芯片后，能够根据荧光捕捉红细胞的迁移图像，从而测定红细胞的移动速率。进一步地，化学物质为脂多糖。进一步地，将经脂多糖处理后的红细胞样品加入到微流控芯片中，检测红细胞的移动速率，与未经脂多糖处理的对照组进行比较，判定经脂多糖处理后，红细胞变形能力是否发生变化，从而判断脂多糖对红细胞变形能力的影响；该方法不用于疾病的诊断和治疗。上述方法在改善红细胞变形能力创新药物筛选中的应用。上述方法在检测治疗脓毒血症的抗生素的药效中的应用。检测过氧化氢酶含量、脂质过氧化物含量、超氧化物歧化酶活性、Na+-K+-ATPase活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性或/和三磷酸腺苷含量的试剂在制备辅助检测脂多糖对红细胞变形能力的影响的试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种给予微流控芯片检测脂多糖对红细胞变形能力影响的方法，能够动态监测红细胞变形性，同时提供单细胞及群体红细胞的变形性参数指标，排除白细胞的干扰。本申请方法具有对样品消耗量少，高通量，便携性好，可视化，易操作等优点，不仅可提供整体的可变形性信息，而且可以提供单细胞的变形性信息。本专利技术通过对红细胞生化指标的测定，发现LPS影响红细胞变形性的主要原因是氧化损伤因素，且发现红细胞生化指标包括过氧化氢酶、脂质过氧化物含量、超氧化物歧化酶活性、Na+-K+-ATPase、谷胱甘肽过氧化物酶活性、三磷酸腺苷含量与红细胞变形性具有较强的相关性，相关系数依次为0.805，-0.787，0.626，0.531，0.509和0.439。本专利技术发现LPS对不同健康志愿者红细胞变形性存在很强的个体化差异。本专利技术不仅可以为临床个体化治疗脓毒血症提供新的理论支持，而且为提高红细胞变形能力的创新药物研发提供了新的筛选方法。由于LPS对红细胞变形性的影响有很强的个体依赖性，因此对于脓毒血症患者用抗生素治疗过程中，基于变形性的筛选可实现个性化医疗的潜在临床益处。附图说明图1为微流控芯片的实验原理图，A为制作芯片的步骤示意图解，B为微流控芯片实体图，C为微流控芯片的微观示意图，D为荧光染色的红细胞在微通道中穿过的变形图。图2为不同浓度LPS对全血红细胞变形能力个体差异的研究。A-I分别代表不同的血液样本。P值代表药物组与对照组(LPS浓度为0pg/mL)之间红细胞迁移速率是否有显着差异：*代表P<0.05，***代表P<0.001。图3为不同浓度LPS对所有健康志愿者红细胞各生化指标的影响，(A)红细胞迁移速度，也指变形性，(B)超氧化物歧化酶活性，(C)Na+-K+-ATP酶活性，(D)三磷酸腺苷含量，(E)谷胱甘肽过氧化物酶活性，(F)过氧化氢酶活性，(G)脂质过氧化物含量和(H)血红蛋白含量，P指药物组与对照组(LPS浓度为0pg/mL)之间是否本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测化学物质对红细胞变形能力影响的方法，其特征在于：将经化学物质处理后的红细胞样品加入到微流控芯片中，检测红细胞的移动速率，与未经化学物质处理的对照组进行比较，判定经化学物质处理后，红细胞变形能力是否发生变化，从而判断化学物质对红细胞变形能力的影响；上述方法不用于疾病的诊断和治疗。

【技术特征摘要】
1.一种检测化学物质对红细胞变形能力影响的方法，其特征在于：将经化学物质处理后的红细胞样品加入到微流控芯片中，检测红细胞的移动速率，与未经化学物质处理的对照组进行比较，判定经化学物质处理后，红细胞变形能力是否发生变化，从而判断化学物质对红细胞变形能力的影响；上述方法不用于疾病的诊断和治疗。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：微流控芯片中含有若干个进样口和出样口，进样口与出样口之间连有微通道；微通道入口处有阻挡装置，防止非红细胞进入并堵塞微通道，微通道内为重复并列排列的三棱柱结构，三棱柱结构间隔为2.8～3.2μm，只允许红细胞变形通过；微通道中三棱柱结构的列数为10列以上。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述阻挡装置为重复并列排列的圆柱结构，圆柱结构直径8～12μm，相邻圆柱结构间隙为8～12μm。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：进样口和出样口的直径为1.2～1.7mm。5.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘利红，刘贞，牛俊心，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44