一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统及其检测方法技术方案

本发明专利技术提供了一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统，该系统涉及一种能与DNA结合的能量供体蛋白质、一种能与DNA结合的能量受体蛋白质、以及由三种DNA探针所组成的核酸组装体系；上述能量供体蛋白质和能量受体蛋白质可与核酸组装体系产生的双链DNA产物进行特异性结合，从而实现了生物发光共振能量转移的信号扩增。本发明专利技术提供的信号扩增系统可应用于不同蛋白质标志物的分析，并提高了生物发光共振能量转移检测方法的灵敏度和通用性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统及其检测方法
本专利技术涉及一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增技术，及其在蛋白质标志物检测中的应用，属于生物医学分析领域。
技术介绍
生物发光共振能量转移是一种以萤光素酶作为能量供体，以荧光分子作为能量受体的生物医学分析技术。该技术无需外源激发光，从而有效避免了传统荧光检测方法中存在的生物自荧光干扰、光漂白、光毒性等问题。此外，基于该技术的自发光特性，相应的检测设备无需配备激发光源，因此可直接通过便携式设备完成检测，具有成本低廉、简便、快速的优点。目前，生物发光共振能量转移技术需要将能够与特定靶标物质进行作用的分子识别元件直接融合在能量供体和受体上，并最终通过上述能量供体和受体对靶标物质的共同作用产生相应的检测信号。然而，上述方法只能将供体和受体对靶标物质的识别转化为单一的检测信号，尚无法实现检测信号的扩增，因此在很多实际应用中存在检测灵敏度偏低的问题。此外，由于核酸适配体、抗体等通用型分子识别元件还无法应用于目前的生物发光共振能量转移技术，因此绝大多数疾病标志物仍然无法通过该技术进行检测与分析。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种灵敏度高、通用型好的信号扩增系统，至少包括能量供体和能量受体，所述的信号扩增系统包括：(1)、能与DNA结合的能量供体蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，包括锌指结构域Zif268的氨基酸序列、萤光素酶结构域的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；(2)、能与DNA结合的能量受体蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，包括绿色荧光蛋白结构域的氨基酸序列、锌指结构域AZP4的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；(3)、核酸组装体系，由三种DNA探针所组成，分别为：DNA探针Probe1、DNA探针Probe2、生物素化的DNA探针Probe3，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.5～SEQIDNO.7所示；生物素化的DNA探针Probe3的核苷酸序列为：ctggatgatgatgagatgagaatgccacgta-TEG-Biotin；上述核酸组装体系产生的双链DNA产物具有锌指结构域Zif268和锌指结构域AZP4的特异性结合位点，能够与能量供体蛋白质及能量受体蛋白质进行特异性结合。本专利技术的第二目的是提供利用上述信号扩增系统进行蛋白质标志物检测的方法，该方法实现了同一信号扩增体系在不同蛋白质标志物检测中的应用，因此具有良好的通用性。该方法通过使用核酸适配体或抗体作为分子识别元件，针对不同种蛋白质标志物进行特异性检测；若分子识别元件为核酸适配体，检测方法为：(1)、核酸适配体免疫磁珠的制备：通过分子交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐将巯基修饰的核酸适配体A1偶联于氨基修饰的磁珠表面，所得样品置于冰箱保存备用，所述巯基修饰的核酸适配体A1的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示：agtccgtggtagggcaggttggggtgact-C6-SH；(2)、基于核酸适配体的蛋白质标志物检测：取上步骤制备所得的核酸适配体免疫磁珠与待测样本、以及核酸适配体A2充分混匀后于室温孵育，再通过磁力架分离磁珠，洗涤后，将磁珠与DNA探针Probe1和Probe2、以及能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于室温孵育，然后利用光谱仪进行分析，得到生物发光共振能量转移信号对蛋白质标志物浓度变化的线性响应关系，完成检测；所述核酸适配体A2中融合有DNA探针Probe3序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；若分子识别元件为抗体，检测方法为：(1)、抗体免疫磁珠的制备：通过Sulfo-SMCC将待测抗体偶联于氨基修饰的磁珠表面，所得样品置于冰箱保存备用；(2)、基于抗体的蛋白质标志物检测：取上步骤制备所得的抗体免疫磁珠与待测样本、链霉亲和素、生物素化的抗体、以及DNA探针Probe3充分混匀后于室温孵育，再通过磁力架分离磁珠，洗涤后，将磁珠与DNA探针Probe1、Probe2、以及能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于室温孵育，然后利用光谱仪进行分析，得到生物发光共振能量转移信号对蛋白质标志物浓度变化的线性响应关系，完成检测。本专利技术还提供了编码上述能量供体蛋白质的基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，包括锌指结构域Zif268的编码序列、萤光素酶结构域的编码序列以及上述两个结构域的连接区的编码序列。以及编码上述能量受体蛋白质的基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，包括绿色荧光蛋白结构域的编码序列、锌指结构域AZP4的编码序列以及上述两个结构域的连接区的编码序列。本专利技术进一步提供了上述能量供体蛋白质的制备方法，包括以下步骤：(1)、能量供体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P1和P2对人工合成的萤光素酶编码片段进行PCR扩增，再通过引物P3和P4对人工合成的锌指结构域Zif268编码片段进行PCR扩增；扩增得到的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行回收后，以等摩尔量混合，最后通过以P3和P2为引物的重叠PCR扩增得到编码能量供体蛋白质的全长基因片段，所得全长基因片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化；所述引物P1、P2、P3和P4的核苷酸序列如SEQIDNO.10～SEQIDNO.13所示；(2)、酶切、连接、及转化：上述全长基因片段经过NdeI和SalI酶切后，分别与经过相同酶切处理的质粒载体pET-26(b+)进行混合，所得混合物通过T4DNA连接酶于连接，连接产物通过CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株当中，所得载体经测序验证正确后用于后续实验；(3)、表达：接种含有能量供体蛋白质表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养，取上述培养物至含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续摇床震荡培养；(4)、纯化：上述所得培养物离心，所得细胞沉淀用细菌蛋白抽提液重悬，并加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破碎，直至样品澄清；将上述裂解液离心，所得上清通过过滤器加入镍亲和层析柱中进行目的蛋白质纯化；纯化所得的能量供体蛋白质于冰箱中透析脱盐，并通过凝胶电泳分析后，分装保存。本专利技术更进一步提供了上述能量受体蛋白质的制备方法，包括以下步骤：(1)、能量受体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P5和P6对人工合成的绿色荧光蛋白编码片段进行PCR扩增，再通过引物P7和P8对人工合成的锌指结构域AZP4编码片段进行PCR扩增；上述扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和回收后，以等摩尔量混合，最后通过以P5和P8为引物的重叠PCR扩增得到编码能量受体蛋白质的全长基因片段，所得全长基因片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化；所述引物P5、P6、P7和P8的核苷酸序列如SEQIDNO.14～SEQIDNO.17所示；(2)、酶切、连接、及转化：上述全长基因片段经过NdeI和SalI酶切后，分别与经过相同酶切处理的质粒载体pET-26(b+)进行混合，所得混合物通过T4DNA连接酶于连接，连接产物通过CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株当中，所得载体经测序验证正确后用于后续实验；(3)、表达：接种含有能量受体蛋白质表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统，至少包括能量供体和能量受体，其特征在于：所述的信号扩增系统包括：(1)、能与DNA结合的能量供体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括锌指结构域Zif268的氨基酸序列、萤光素酶结构域的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；(2)、能与DNA结合的能量受体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，包括绿色荧光蛋白结构域的氨基酸序列、锌指结构域AZP4的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；(3)、核酸组装体系，由三种DNA探针所组成，分别为：DNA探针Probe1、DNA探针Probe2、生物素化的DNA探针Probe3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示；上述核酸组装体系产生的双链DNA产物具有锌指结构域Zif268和锌指结构域AZP4的特异性结合位点，能够与能量供体蛋白质及能量受体蛋白质进行特异性结合。

【技术特征摘要】
1.一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统，至少包括能量供体和能量受体，其特征在于：所述的信号扩增系统包括：(1)、能与DNA结合的能量供体蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，包括锌指结构域Zif268的氨基酸序列、萤光素酶结构域的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；(2)、能与DNA结合的能量受体蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，包括绿色荧光蛋白结构域的氨基酸序列、锌指结构域AZP4的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；(3)、核酸组装体系，由三种DNA探针所组成，分别为：DNA探针Probe1、DNA探针Probe2、生物素化的DNA探针Probe3，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.5～SEQIDNO.7所示；上述核酸组装体系产生的双链DNA产物具有锌指结构域Zif268和锌指结构域AZP4的特异性结合位点，能够与能量供体蛋白质及能量受体蛋白质进行特异性结合。2.权利要求1所述基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统在蛋白质标志物检测中的应用。3.一种利用权利要求1所述信号扩增系统进行蛋白质标志物检测的方法，其特征在于：该方法通过使用核酸适配体或抗体作为分子识别元件，针对不同种蛋白质标志物进行特异性检测；若分子识别元件为核酸适配体，检测方法为：(1)、核酸适配体免疫磁珠的制备：通过分子交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐将巯基修饰的核酸适配体A1偶联于氨基修饰的磁珠表面，所得样品置于冰箱保存备用，所述巯基修饰的核酸适配体A1的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；(2)、基于核酸适配体的蛋白质标志物检测：取上步骤制备所得的核酸适配体免疫磁珠与待测样本、以及核酸适配体A2充分混匀后于室温孵育，再通过磁力架分离磁珠，洗涤后，将磁珠与DNA探针Probe1和Probe2、以及能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于室温孵育，然后利用光谱仪进行分析，得到生物发光共振能量转移信号对蛋白质标志物浓度变化的线性响应关系，完成检测；所述核酸适配体A2中融合有DNA探针Probe3序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；若分子识别元件为抗体，检测方法为：(1)、抗体免疫磁珠的制备：通过Sulfo-SMCC将待测抗体偶联于氨基修饰的磁珠表面，所得样品置于冰箱保存备用；(2)、基于抗体的蛋白质标志物检测：取上步骤制备所得的抗体免疫磁珠与待测样本、链霉亲和素、生物素化的抗体、以及DNA探针Probe3充分混匀后于室温孵育，再通过磁力架分离磁珠，洗涤后，将磁珠与DNA探针Probe1、Probe2、以及能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于室温孵育，然后利用光谱仪进行分析，得到生物发光共振能量转移信号对蛋白质标志物浓度变化的线性响应关系，完成检测。4.编码权利要求1所述能量供体蛋白质的基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，包括锌指结构域Zif268的编码序列、萤光素酶结构域的编码序列以及上述两个结构域的连接区的编码序列。5.权利要求1所述能量供体蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、能量供体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P1和P2对...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，吴云华，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42