基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含向导ssDNAs，基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)和荧光报告核酸。本发明专利技术的核酸检测方法灵敏度高、特异性好、通量高，可广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。

【技术实现步骤摘要】
基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。
技术介绍
核酸检测技术广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。快速、廉价和灵敏的核酸检测可广泛应用于病原体检测、基因分型、病程监测等方面。一些传统的核酸检测方法(qPCR、测序、核酸印记等)虽然已经有广泛应用，然而，仍存在一些缺点。例如qPCR和高通量测序等存在耗时长，费用高，设计原理复杂等缺点。此外，对于数量极其微少的待检测核酸，本领域尚缺乏令人满意的检测方法。目前，利用基因编辑酶作为核酸检测的方法有利用C2C2酶介导的旁系剪切效应对目标RNA进行检测。但是尚缺乏对目标DNA(尤其是微量DNA)进行快速、有效检测的方法。因此，本领域迫切需要开发针对目标DNA的灵敏度高、特异性好、通量高的核酸检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种基于对目标DNA的灵敏度高、特异性好、通量高的核酸检测方法及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含：(a)向导ssDNA对；(b)基因编辑酶Pyrococcusfuriosus(PfAgo)；和(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。在另一优选例中，所述的向导ssDNA对包括有义链向导ssDNA和反义链向导ssDNA。在另一优选例中，所述的向导ssDNA为5’-磷酸化的单链DNA分子。在另一优选例中，所述的向导ssDNA的长度为n个碱基，且n≥14。在另一优选例中，所述的n≤100，较佳地≤80，更佳地≤60。在另一优选例中，所述的向导ssDNAs的长度为14-60nt，较佳地16-40nt。在另一优选例中，所述的向导ssDNAs的数量为一对或多对。在另一优选例中，所述PfAgo酶来源于古菌Pyrococcusfuriosus。在另一优选例中，所述的PfAgo包括野生型和突变型的PfAgo。在另一优选例中，所述靶标核酸分子的不同分型对应的突变位点在向导ssDNA的第10、11位。在另一优选例中，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。在另一优选例中，所述的检测体系还包括用于对靶标核酸分子进行扩增的引物。在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。在另一优选例中，所述的靶标核酸分子(或其扩增产物)被所述PfAgo酶切割后，产生次级向导ssDNA。在另一优选例中，所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列是互补的。在另一优选例中，所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列互补结合后，引导所述PfAgo酶对所述荧光报告核酸进行切割，从而产生可检测的信号(如荧光)。在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1-1000拷贝/微升或103-1010拷贝/微升，较佳地100-1000拷贝/微升，更佳地1-100拷贝/微升。在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1fM-200pM，较佳地1-1000fM，更佳地1-100fM，最佳地1-20fM。在另一优选例中，所述基因编辑酶的工作温度为87-99℃。在另一优选例中，所述的检测体系中，所述荧光报告核酸的浓度为100-1000nM。在另一优选例中，所述的检测体系中，所述荧光报告核酸与所述靶标核酸分子的摩尔比为103：1至108：1，较佳地104：1至107：1。在另一优选例中，所述的靶标DNA包括cDNA。在另一优选例中，所述的靶标DNA选自下组：单链DNA(包括cDNA)、双链DNA、或其组合。在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述荧光报告核酸的5’端、3’端。在另一优选例中，所述的荧光报告核酸的长度为9-100nt，较佳地10-60nt，更佳地15-40nt。在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、微生物、病毒、或其组合。在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。在本专利技术的第二方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)本专利技术第一方面所述的检测体系或用于配制所述检测体系的试剂；和(ii)使用说明书，所述说明书描述了用所述的检测体系检测靶标核酸分子的方法。在另一优选例中，所述试剂盒还可以包括缓冲液。在另一优选例中，所述的试剂盒包括：(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导ssDNA；(b)第二容器以及位于第二容器的酶PyrococcusfuriosusArgonaute(PfAgo)；和(c)第三容器以及位于第三容器的荧光报告核酸。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：(d)第四容器以及位于第四容器的用于酶进行酶切的缓冲液。在另一优选例中，所述的用于酶进行酶切的缓冲液含有MnCl2。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：(f)第五容器以及位于第五容器的用于扩增靶标核酸分子的引物或引物对；(g)任选的第六容器以及位于第六容器的用于扩增反应的聚合酶；和(h)任选的第七容器以及位于第七容器的用于扩增反应的扩增缓冲液。在本专利技术的第三方面，提供了一种检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，包括以下步骤：(a)提供本专利技术第一方面所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系；和(b)将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成第一反应溶液；(c)对所述第一反应溶液进行荧光检测，从而获得荧光信号值；其中，所述第一反应溶液中检测到荧光信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述第一反应溶液中没有检测到荧光信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。在另一优选例中，所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核酸扩增)的样本。在另一优选例中，所述的待检测的样本是经过扩增而获得的样本。在另一优选例中，所述核酸扩增的方法选自下组：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增和滚环扩增。在另一优选例中，所述的PCR包括高温PCR、常温PCR、低温PCR。在另一优选例中，所述方法用于检测靶位点处的核酸是否在SNP、点突变、缺失、和/或插入。在另一优选例中，在步骤(b)中所述荧光检测采用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测。在另一优选例中，所述的方法是体外方法。在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。在本专利技术的第四方面，提供了一种核酸酶PyrococcusfuriosusArgonaute的用途，用于制备基于二次切割检测靶标核酸分子的试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述酶PyrococcusfuriosusArgonaute来源于古菌Pyrococcusfuriosus；或是其具备相同或相似功能的同源类似物。在另一优选例中，所述的PfAgo包括野生型和突变型的PfAgo。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了本专利技术基因编码酶的第一次切割本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，该体系包含：(a)向导ssDNA对；(b)基因编辑酶Pyrococcus furiosus(PfAgo)；和(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，该体系包含：(a)向导ssDNA对；(b)基因编辑酶Pyrococcusfuriosus(PfAgo)；和(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的向导ssDNAs的长度为14-60nt，较佳地16-40nt。3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述PfAgo酶来源于古菌Pyrococcusfuriosus。4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述靶标核酸分子的不同分型对应的突变位点在向导ssDNA的第10、11位。5.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的靶标核酸分子(或其扩增产物)被所述PfAgo酶切割后，产生次级向导ssDNA。6.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1fM-200pM，较佳地1-1000fM，更佳地1-100fM，最佳地1-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯雁，荀冠华，刘倩，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31