棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种棉花长链非编码RNA lncRNA‑lnc973序列及其在植物耐盐性中的应用，所述的lncRNA‑lnc973的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过PCR证实了lncRNA‑lnc973的客观存在，且在盐胁迫条件下其表达量显著提高。克隆棉花lncRNA‑lnc973全长转录本，构建过表达载体转化野生型拟南芥，转基因拟南芥提高了耐盐性；通过病毒诱导基因沉默技术，构建VIGS敲除载体，转染棉花叶片，结果证实，VIGS敲除后棉花lnc973的表达量显著降低，耐盐性下降。这表明过表达棉花lncRNA‑lnc973可以提高植物的耐盐性。

【技术实现步骤摘要】
棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用。
技术介绍
棉花既是主要的纤维作物，也是重要的油料作物，它虽然是比较耐盐的农作物，但是，土壤盐渍化不仅限制棉花生长，而且还影响其产量及纤维品质，给棉花生产造成极大损失。因此，研究棉花耐盐调控机理，克隆棉花耐盐相关基因及调控元件，开展棉花的转基因研究，是提高棉花盐碱育种的核心关键技术。长链非编码RNA是长度大于200bp，且不具有编码蛋白质功能的一类RNA分子。根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以将lncRNA分为5类：正义(sense)、反义(antisense)、双向(bidirectional)、基因内(intronic)、及基因间(intergenic)。长期以来，lncRNA一直被作为是转录过程中产生的“噪音”而被忽视。lncRNA的长度普遍更短，保守性较差并且表达水平明显低于蛋白编码基因。近年来大量研究结果表明，长链非编码RNA参与多个生物代谢进程，具有很多生物学功能，参与剂量补偿、基因组印记、染色体重塑、可变剪切、细胞核亚结构组装等众多生物进程。lncRNA没有一种普遍的作用模式，它可以以不同的方式来调控基因表达和蛋白合成，如通过顺式(cis)或反式(trans)作用调控编码基因的表达，除此之外还可以作为miRNA的“sponge”，竞争性地结合miRNA，进而影响miRNA对下游靶基因的调控。lncRNA可以在多个层面上对基因表达进行调控，包括表观遗传学水平调控、转录水平调控以及转录后水平调控几个方面。近几年来，lncRNA逐渐被植物学家重视，除了在模式植物拟南芥中发现了lncRNA之外，水稻、小麦、玉米和棉花中也陆续有所发现。在植物lncRNA方面的研究表明，植物lncRNA与基因表达调控，植物花期调控以及重要的生物代谢途径密切相关。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一个棉花盐胁迫相关的长链非编码RNAlncRNA-lnc973，探索其在棉花耐盐过程中的作用机制，进而应用该长链非编码RNA改良棉花的耐盐性，创造耐盐棉花优良品种。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种棉花长链非编码RNA，其为lncRNA-lnc973，具有：1)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或2)与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有90％以上序列同源性，且功能上与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列等同。本专利技术的第二方面，提供含有上述棉花长链非编码RNA的植物表达载体。进一步的，本专利技术还提供包含上述植物表达载体的重组菌。本专利技术的第三方面，提供上述棉花长链非编码RNA、植物表达载体或重组菌在提高植物耐盐性中的应用。本专利技术的第四方面，提供上述棉花长链非编码RNA、植物表达载体或重组菌在植物育种方面的应用。所述植物育种为培育耐盐植物品种。本专利技术的第五方面，提供一种提高植物耐盐性的方法，包括：将本专利技术第一方面所述基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物为拟南芥。本专利技术的有益效果：本专利技术首次从棉花中分离得到一个与植物耐盐性相关的棉花长链非编码RNAlncRNA-lnc973。本专利技术的lncRNA-lnc973可作为基因资源在农业生产上使用或选育转基因植物以提高耐盐性，具有广泛的应用价值。附图说明图1为lncRNA-lnc973的基因结构。图2为lncRNA-lnc973在0mmol/L和250mmol/LNaCl处理陆地棉山农91-11真叶中的表达量结果图。图3为克隆lncRNA-lnc973的扩增结果。左泳道为DNAmarker，DNA分子量标准为DL2000，右泳道为lncRNA-lnc973的PCR扩增片段为2134bp。图4为双酶切鉴定单克隆pMD19-lnc973，所用DNAmarker为DL5000。图5为双酶切鉴定单克隆过表达载体pCAMBIA1300-lnc973-eGFP，过表达载体pCAMBIA1300-eGFP质粒大小为12291bp，所用DNAmarker为DL10000bp。图6为PCR扩增鉴定阳性转基因植株，Marker为DL10000，1-4为阳性植株。图7为转基因阳性植株表型鉴定结果，A、B分别为0mmol/L和100mmol/LNaCl处理7天内转基因和野生型拟南芥种子萌发率情况；C为NaCl处理后相对鲜重的统计；D为NaCl处理后相对根长的统计。图8为不同浓度NaCl处理下转基因和野生型拟南芥根长的比较图。图9为VIGS载体敲除lnc973片段和阳性对照GhCLA1PCR产物电泳结果，Marker为DL2000，lnc973敲除片段大小为500bp，GhCLA1敲除片段为465bp。图10为双酶切鉴定单克隆VIGS载体pTRV2-lnc973和pTRV2-GhCLA1，Marker为DL2000。图11为RT-PCR鉴定VIGS敲除的阳性植株，TRV2为对照陆地棉，UBQ7为内参基因对照，Marker为DL2000。图12为250mmol/LNaCl处理pTRV2-lnc973阳性植株的表型鉴定，以及GhCLA1敲除后白化表型。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
部分所介绍的，lncRNA与植物的多种代谢途径密切相关，但与棉花耐盐性相关的lncRNA还未见报道。基于此，本专利技术的目的是提供一种棉花盐胁迫相关的长链非编码RNA，并将其用于耐盐棉花的育种。本专利技术利用RNA测序(RNA-seq)术，在0mmol/L和250mmol/LNaCl处理陆地棉山农91-11中筛选出表达差异显著的长链非编码RNAlncRNA-lnc973。lncRNA-lnc973定位于陆地棉D基因组的第四号染色体，长度为3296bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，属于lincRNA。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQIDNO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该核苷酸具有90％以上同源性，且具有相同的功能，则均属于本专利技术保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。通过结构分析网站GSDS分析了lnc973的结构(图1)，第一个转录本lnc973.1含有两个外显子(exon)，一个内含子(intron)和一个非编码区(UTR)。本专利技术使用荧光定量PCR的方法，验证了RNA-seq结果的可靠性，在NaCl处理下陆地棉山农91-11的lnc973表达量显著提高，其lnc973序列通过PCR及测序验证了其客观存在。本专利技术还克隆lnc973第一个转录本序列，将克隆片段连入克隆载体pMD19-T后测序鉴定，通过构建过表达载体，通过KpnⅠ和PstⅠ酶切过表达载体pCAMBIA1300-eGFP和克隆载体pMD19-T，胶回收线性化过表达载体pCAMBIA1300-eGFP和目的片段进行连接，构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种棉花长链非编码RNA，其为lncRNA‑lnc973，其特征在于，具有：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种棉花长链非编码RNA，其为lncRNA-lnc973，其特征在于，具有：1)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或2)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸。2.含有权利要求1所述棉花长链非编码RNA的植物表达载体。3.含有权利要求2所述植物表达载体的重组菌。4.权利要求1所述的棉花长链非编码RNA、权利要求2所述的植物表达载体或权利要求3所述的重组菌在植物育种方面的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈法富，张晓佩，王维，陈懂懂，刘丹，程莹莹，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37