一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法技术

本发明专利技术提供一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，包括如下步骤：将含有丙酮酸氧化酶的表达基因的重组大肠杆菌pET28a‑pod接种至固体培养基上进行活化，得到活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod；将活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod接种至放于摇床上的LB培养基并进行摇动，得到活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod的种子液；接种该种子液至TB培养基进行培养，培养至浓度为第一细胞浓度后加入诱导剂进行诱导，当浓度为第二细胞浓度后不断加入盐酸溶液进行发酵至pH值为5.5‑6.5，然后继续诱导，得到菌液I；取菌液I进行离心后倒去上清液，用PBS溶液洗涤两次后用等体积的PBS溶液进行重悬，得到重悬液；对重悬液进行超声破碎，得到超声破碎后的菌液II；取菌液II进行离心，收集含有丙酮酸氧化酶的上清液。

【技术实现步骤摘要】
一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法。
技术介绍
丙酮酸氧化酶可用于丙酮酸、丙酮酸激酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、无机磷、唾液酸、唾液酸激酶以及尿素的检测，是生化检测试剂盒中十分重要的组成成分。近年来，有学者报道了可发酵生产丙酮酸氧化酶的野生型菌株，如植物乳杆菌、绿色气球菌和大肠杆菌。在这些野生型菌株中，来源于绿色气球菌的丙酮酸氧化酶因其良好的性能被作为生化检测试剂中的主要成分。但来源于绿色气球菌的丙酮酸氧化酶的发酵产量较低为120U/L，所以需要开发新技术以提高其产量。基因工程技术是提高外源蛋白产量的良好选择。目前报道了一些表达外源蛋白的代表微生物，如巴斯德毕赤酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等。在所有重组微生物中，大肠杆菌因其清晰的遗传模式、高产量的重组蛋白被认为是表达外源蛋白中最成功的重组微生物。在生产发酵中，重组大肠杆菌具有高生长速率和易于控制培养的优点。因此，将来源于绿色气球菌中的丙酮酸氧化酶在重组大肠杆菌中表达是很合理的。参见参考文献1中Zhao等人构建了含有pSML载体的重组大肠杆菌，丙酮酸氧化酶的产量为670U/L。在我们之前的研究中，构建了重组大肠杆菌pET28a-pod，其中包含了进行密码子优化的丙酮酸氧化酶基因片段，经过诱导剂和温度优化后，丙酮酸氧化酶的产量达到了4106.9U/L参见参考文献2。但在扩大培养重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶时，大量具有活性的丙酮酸氧化酶自发地形成了无活性的包涵体。因此，在后期更高密度培养中，需要降低丙酮酸氧化酶向包涵体变化的过程，最终才能得到高产量的可溶性丙酮酸氧化酶。参考文献1：ZhaoJ,WangY,ChuJ,ZhangS,ZhuangY,YuanZ(2008)StatisticaloptimizationofmediumfortheproductionofpyruvateoxidasebytherecombinantEscherichiacoli.JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology35(4):257-262(ZhaoJ，WangY，ChuJ，ZhangS，ZhuangY，YuanZ(2008)重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶培养基的统计学优化，工业微生物和生物技术杂志，35(4):257-262)。参考文献2：LuJ,ZhaoY,ZhangJ(2018)High‐levelexpressionofAerococcusviridanspyruvateoxidaseinEscherichiacolibyoptimizationofvectorsandinductionconditions.LettApplMicrobiol.doi:doi:10.1111/lam.13013(LuJ，ZhaoY,，ZhangJ(2018)优化质粒和诱导条件使重组大肠杆菌高效表达丙酮酸氧化酶的研究，应用微生物通讯，doi:doi:10.1111/lam.13013[A1])。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一直获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法。本专利技术提供了一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，具有这样的特征，包括如下步骤：步骤1，将含有丙酮酸氧化酶的表达基因的重组大肠杆菌pET28a-pod接种至固体培养基上，在第一预定温度下培养第一预定时间后活化，得到活化的重组大肠杆菌pET28a-pod；步骤2，将活化的重组大肠杆菌pET28a-pod接种至LB培养基，而后将该LB培养基放置于摇床上，在第二预定温度下以第一速度摇动第二预定时间，得到活化的重组大肠杆菌pET28a-pod的种子液；步骤3，接种一定量的种子液至TB培养基，在第三预定温度下将种子液培养至种子液的浓度为第一细胞浓度后加入诱导剂进行诱导，在第四预定温度下以第二速度摇动第三预定时间直至浓度为第二细胞浓度，而后不断加入盐酸溶液进行发酵直至pH值为5.5-6.5，然后继续诱导，得到菌液I；步骤4，取一定质量的菌液I在第五预定温度下离心第四预定时间后倒去上清液，而后用PBS溶液洗涤两次，再用等体积的PBS溶液进行重悬，得到重悬液；步骤5，将重悬液置于超声变幅杆中进行超声破碎，得到超声破碎后的菌液II；步骤6，取一定质量的菌液II在第六预定温度下离心第五预定时间后，收集含有丙酮酸氧化酶的上清液。在本专利技术提供的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1中的固体培养基的成分为5％酵母粉、1.0％胰蛋白胨、1.0％氯化钠以及2.0％琼脂粉，第一预定温度为37℃，第一预定时间为12h。在本专利技术提供的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中的LB培养基的成分为0.5％酵母粉、1.0％胰蛋白胨以及1.0％氯化钠，第二预定温度为37℃，第一速度为200rpm，第二预定时间为12h。在本专利技术提供的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤3中的TB培养基的成分为2.4％酵母粉、1.2％胰蛋白动、0.4％甘油、0.23％磷酸二氢钾以及1.7％磷酸氢二钾，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，种子液的接种量为种子液的总量的5％，第三预定温度为37℃，第一细胞浓度为7.5×107-8.8×107cfu/mL，第四预定温度为20-30℃，第二速度为200rpm，第三预定时间为12-20h，第二细胞浓度为0.1-1.0mmol/L，盐酸溶液的浓度为2mol/L。在本专利技术提供的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤4中的菌液I的一定质量为12000g，第五预定温度为4℃，第四预定时间5min，PBS溶液的浓度为0.1mol/L，PBS溶液的pH值为6.8。在本专利技术提供的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤5中的超声变幅杆的直径为2mm，超声破碎的超声功率为150W。在本专利技术提供的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤5中的进行超声破碎包括如下子步骤：将重悬液置于超声变幅杆中，开启超声破碎，超声4s后，停歇6s，如此重复直至进行超声破碎的总时间满3min后关闭超声破碎，得到超声破碎后的菌液II。在本专利技术提供的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤7中的菌液II的一定质量为12000g，第六预定温度为4℃，第五预定时间为5min。专利技术的作用与效果根据本专利技术所涉及的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，方法简单，操作方便，并且首次发现细胞质的pH值会显著影响表达的丙酮酸氧化酶形成包涵体，通过发酵液环境的pH值改变细胞质的pH值，最终极大程度地减少了丙酮酸氧化酶形成的包涵体数量，还能够在不改变培养基组分、不改变发酵条件的下，最大程度地减少丙酮酸氧化酶形成包涵体，达到了目前重组大肠杆菌生产丙酮酸氧化酶的最高产量，因此具有极好的产业价值。附图说明图1是本专利技术的实施例一和实施例三种对重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶活力的影响对比示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，将含有丙酮酸氧化酶的表达基因的重组大肠杆菌pET28a‑pod接种至固体培养基上，在第一预定温度下培养第一预定时间后活化，得到活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod；步骤2，将所述活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod接种至LB培养基，而后将该LB培养基放置于摇床上，在第二预定温度下以第一速度摇动第二预定时间，得到所述活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod的种子液；步骤3，接种一定量的所述种子液至TB培养基，在第三预定温度下将所述种子液培养至所述种子液的浓度为第一细胞浓度后加入诱导剂进行诱导，在第四预定温度下以第二速度摇动第三预定时间直至浓度为第二细胞浓度，而后不断加入盐酸溶液进行发酵直至pH值为5.5‑6.5，然后继续诱导，得到菌液I；步骤4，取一定质量的所述菌液I在第五预定温度下离心第四预定时间后倒去上清液，而后用PBS溶液洗涤两次，再用等体积的所述PBS溶液进行重悬，得到重悬液；步骤5，将所述重悬液置于超声变幅杆中进行超声破碎，得到超声破碎后的菌液II；步骤6，取一定质量的菌液II在第六预定温度下离心第五预定时间后，收集含有所述丙酮酸氧化酶的上清液。...

【技术特征摘要】
1.一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，将含有丙酮酸氧化酶的表达基因的重组大肠杆菌pET28a-pod接种至固体培养基上，在第一预定温度下培养第一预定时间后活化，得到活化的重组大肠杆菌pET28a-pod；步骤2，将所述活化的重组大肠杆菌pET28a-pod接种至LB培养基，而后将该LB培养基放置于摇床上，在第二预定温度下以第一速度摇动第二预定时间，得到所述活化的重组大肠杆菌pET28a-pod的种子液；步骤3，接种一定量的所述种子液至TB培养基，在第三预定温度下将所述种子液培养至所述种子液的浓度为第一细胞浓度后加入诱导剂进行诱导，在第四预定温度下以第二速度摇动第三预定时间直至浓度为第二细胞浓度，而后不断加入盐酸溶液进行发酵直至pH值为5.5-6.5，然后继续诱导，得到菌液I；步骤4，取一定质量的所述菌液I在第五预定温度下离心第四预定时间后倒去上清液，而后用PBS溶液洗涤两次，再用等体积的所述PBS溶液进行重悬，得到重悬液；步骤5，将所述重悬液置于超声变幅杆中进行超声破碎，得到超声破碎后的菌液II；步骤6，取一定质量的菌液II在第六预定温度下离心第五预定时间后，收集含有所述丙酮酸氧化酶的上清液。2.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：其中，所述步骤1中的所述固体培养基的成分为5％酵母粉、1.0％胰蛋白胨、1.0％氯化钠以及2.0％琼脂粉，所述第一预定温度为37℃，所述第一预定时间为12h。3.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：其中，所述步骤2中的所述LB培养基的成分为0.5％酵母粉、1.0％胰蛋白胨以及1.0％氯化钠，所述第二预定温度为37℃，第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建国，卢俊文，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31