一种牙髓干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓干细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括如下步骤：采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。本发明专利技术采用I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶对牙髓组织进行消化，在维持细胞活力的同时，可充分消化牙髓组织，使牙髓干细胞游离出来，得到的牙髓干细胞数量多，且活力强。

【技术实现步骤摘要】
一种牙髓干细胞的分离培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，特别涉及一种牙髓干细胞的分离培养方法。
技术介绍
牙周炎是累及四种牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。在35岁以后较为多见。常见病因为菌斑、牙石、创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗(洁治、刮治、根面平整)、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。但这些方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颌面部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。牙髓干细胞(dentalpulpstemcells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。目前，常用的牙髓干细胞提取方法为采用I型胶原酶或者I型胶原酶与中性蛋白酶(又称分散酶)消化牙髓组织。但该法得到的牙髓干细胞总数量少，细胞活率低。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法。该方法得到的牙髓干细胞数量多，且活力强。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。作为优选，I型胶原酶的质量百分浓度为0.1％～0.5％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.01％～0.2％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.01％～0.2％。优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.2％～0.4％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％。更优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.3％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.1％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.1％。作为优选，I型胶原酶、III型胶原酶与胰蛋白酶的质量比为4:3:3～8:1:1。优选地，I型胶原酶、III型胶原酶与胰蛋白酶的质量比为3:1:1。作为优选，过筛的孔径为60～80μm。优选的，过筛的孔径为70μm。作为优选，牙髓组织为0.3～0.5mm3块状牙髓组织。作为优选，消化的温度为36～38℃，转速为180～220r/min，消化的时间为10～20min。优选的，消化的温度为37℃，转速为200r/min，消化的时间为15min。作为优选，含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基为含有8～12ng/mLFGF、8％～12％FBS的DMEM/F12培养基。优选的，含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基为含有10ng/mLFGF、10％FBS的DMEM/F12培养基。本专利技术提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括如下步骤：采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。本专利技术具有的技术效果为：本专利技术采用I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶对牙髓组织进行消化，在维持细胞活力的同时，可充分消化牙髓组织，使牙髓干细胞游离出来，得到的牙髓干细胞数量多，且活力强。具体实施方式本专利技术公开了一种牙髓干细胞的分离培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。术语解释：PBS：磷酸缓冲盐溶液；FBS：胎牛血清；FGF：成纤维细胞生长因子。本专利技术提供的牙髓干细胞的分离培养方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1牙髓干细胞的分离培养和传代1、分离和传代选用普通级瞬目反射正常的健康大白兔为实验对象，雌雄随机，兔龄4-5个月。大白兔在局麻的状态下拔出一颗磨牙，在保证牙髓未被破坏的情况下，立即转移至预冷高浓度双抗中(双抗：链霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反复冲洗3次，在无菌操作台劈开牙齿，取出牙髓组织。用眼剪把牙髓组织剪成0.3-0.5mm3块状，置于含0.3％I型胶原酶、0.1％III型胶原酶和0.1％胰蛋白酶的消化液中，在37℃的温度下，200rpm消化15min，过70μm筛，用PBS清洗2次，用无血清培养基重悬，计算细胞总量及细胞活力；之后接种培养(DMEM/F12+10％FBS+10ng/mlFGF)，每3天换液，细胞汇合度75％-85％时进行传代培养。牙髓干细胞传代到第3代，汇合度在85-90％时，用PBS清洗两遍后，加入3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置显微镜下观察，80％细胞皱缩变圆时，加入5mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。把细胞悬液转移至50mL离心管中，600g离心5min。离心结束后倒弃上清液，往细胞沉淀中加入20-30mL的生理盐水重悬细胞，600g离心5min，弃上清液(该步骤重复一次)。2、牙髓干细胞检测牙髓干细胞收集前24h抽取培养液上清检测细菌、真菌、内毒素和支原体，结果均呈阴性，表明牙髓干细胞微生物量达标；牙髓干细胞收集时对其直径和活力进行检测和观察，结果显示，牙髓干细胞在P3代时，细胞大小均匀、形态均为梭型，融合至85％时呈现漩涡状。消化收集时，97％以上的细胞拒染(死细胞被染成蓝色，活细胞拒染)，细胞直径在14-18μm之间，符合牙髓干细胞体积大小分布，说明了牙髓干细胞并没有出现体积变大等异常现象，活力较好。牙髓干细胞表面抗原流式检测结果显示，牙髓干细胞高表达CD146和CD90，表达率分别为99.9％，100％；低表达CD34和CD45，表达率分别为0.1％、0.1％，符合间充质干细胞表面抗原特征，说明了牙髓干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。实施例2牙髓干细胞的分离培养和传代1、分离和传代选用普通级瞬目反射正常的健康大白兔为实验对象，雌雄随机，兔龄4-5个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牙髓干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。

【技术特征摘要】
1.一种牙髓干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶的质量百分浓度为0.1％～0.5％，所述III型胶原酶的质量百分浓度为0.01％～0.2％，所述胰蛋白酶的质量百分浓度为0.01％～0.2％。3.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶的质量百分浓度为0.2％～0.4％，所述III型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％，所述胰蛋白酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％。4.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶的质量百分浓度为0.3％，所述III型胶原...

【专利技术属性】
技术研发人员：李首一，石晓川，
申请(专利权)人：吉林省太阳鸟再生医学工程有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22