一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法技术

本发明专利技术提供一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，包括：诱导培养步骤：带芽茎段为外植体接种到诱导培养基上培养形成无菌试管苗；继代增殖步骤：将无菌试管苗转接到增殖培养基上进行增殖获得的无根组培苗，以增殖的无根组培苗作为微嫁接的接穗；砧木培养步骤：将棠梨种子接种到种子萌发培养基上培养形成砧木；微嫁接步骤：将接穗削成楔形的基部插入砧木的切口中，获得微嫁接苗；炼苗移栽步骤：将嫁接苗炼苗后移栽于栽培基质中，移栽后在塑料拱棚内培养。本发明专利技术结合组织培养和嫁接技术，利用增殖的组培苗和实生棠梨苗进行微嫁接，省去了组培苗生根的诱导过程，简化了育苗的程序，缩短了育苗时间，提高了苗木的抗逆能力和丰产性能。

【技术实现步骤摘要】
一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法
本专利技术涉及砂梨育苗繁殖
，具体涉及一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法。
技术介绍
淡水砂梨是以产地命名的著名砂梨，主产在广东惠州市惠阳区淡水，即叶挺将军的故乡，其果实耐贮运，色泽朗润，果肉爽脆、多汁，在港澳和东南亚地区深受人们的青睐，曾享誉岭南。淡水砂梨随着改革开放后惠阳区制造和加工工业的发展以及当地荔枝、龙眼等果树的推广种植，淡水砂梨栽培面积大为减少，淡水砂梨产业渐趋衰落。目前淡水砂梨产业有“已不存”的说法(赵飞，倪根金，章家恩.惠阳淡水沙梨栽培历史考述.农业考古，2013，(3):158-165)，淡水砂梨种质资源现状堪忧。淡水砂梨作为地方特有经济作物，适应南方高温高湿气候，具有独特和明显的种质优势，为促进淡水砂梨产业的发展和保存具有地方特色的种质资源，本专利专利技术人曾令达研究了淡水沙梨通过组织培养方法进行快速繁殖的方法，发现了适合淡水砂梨的初代培养、继代培养和生根诱导的方法及相应的培养基配方。淡水砂梨传统栽培生产中为提高淡水砂梨的抗逆能力和丰产性能，均以淡水砂梨优良母株的枝梢做接穗，采用当地棠梨实生苗做砧木进行嫁接来培育优良嫁接苗。通过组织培养方法快速繁殖的淡水砂梨苗木虽具有淡水砂梨母株的优良特征，且具有与优良母株相同的整套遗传信息，但直接由试管试管苗生根形成的组培苗并不具棠梨的实生根系，也即梨苗不具有适应当地土壤环境的根系，没有传统嫁接苗所具有的抗逆能力和丰产基础。另外，砂梨为难生根的木本植物，利用组织培养直接促增殖试管苗生根，因受试管苗的生理状态的影响，生根率不高且有不稳定现象。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成活率高，能快速繁殖出抗逆性强的淡水砂梨组培苗的微嫁接方法。为实现上述技术目的，本专利技术采用以下的技术方案。本专利技术提供一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，包括：诱导培养步骤：将淡水砂梨外植体置于0.1％-0.3％的升汞溶液消毒10-16分钟，然后用无菌水冲洗5-6次，经无菌滤纸吸干水分后，用接种刀切成带1-3个顶芽和/或侧芽的长为0.5-2cm的带芽茎段，将所述带芽茎段为外植体接种到已灭菌并凝固的诱导培养基上，将接种后的诱导培养基先暗培养5-10天，再在光培养条件下诱导外植体茎段的顶芽或侧芽萌发，形成无菌试管苗；继代增殖步骤：在无菌条件下将诱导培养的高为2-4cm的无菌试管苗用接种刀切下转接到已灭菌并凝固的增殖培养基上进行增值，并进行光培养30-40天，促无菌试管苗的侧芽或不定芽萌发获得丛生的无根组培苗，将无根组培苗在无菌条件下用接种刀切分为单株组培苗，选取高于1.5cm的单株组培苗转接到增殖培养基上，多次继代培养获得无根组培苗，经继代培养30-40天后的无根组培苗作为微嫁接的接穗；砧木培养步骤：将后熟处理过的棠梨种子用缓慢流水冲洗30-60分钟，晾干后用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3次后沥干，用0.1％-0.3％升汞溶液消毒4-8分钟，消毒结束用无菌水漂洗5-6次，然后接种到已灭菌并凝固的种子萌发培养基上，将接种后的种子萌发培养基先暗培养5-10天，然后在光培养条件下诱导种子萌发，形成无菌的棠梨幼苗，棠梨幼苗生长到第二片真叶形成时作为微嫁接的砧木；试管内微嫁接步骤：将锡纸裁成0.5cm×1.5cm的条形，经高压灭菌后备用；在无菌条件下，取出砧木将其截顶，留3-4cm长的茎，将底部侧芽和叶片用镊子摘除，沿砧木茎段顶部纵切形成长度为0.4-0.6cm的切口；选取高度为2-5cm、粗度与砧木茎段相近的接穗，在接穗的顶部留2-6片叶子，并将其基部削成长度为0.4-0.6cm的楔形结构，将接穗的楔形基部插入砧木苗茎段的切口中，使切口密贴，砧木和接穗至少有一边的边缘对齐，用锡纸将嫁接口绑缚，获得微嫁接苗；并将微嫁接苗放入已灭菌并冷却至室温的盛有液体培养基的试管中，液体培养基占试管体积的1/4，液体培养基表面放入锡纸以固定嫁接苗使液体不没过嫁接苗的根茎部位，用无菌封口膜封住试管口，将微嫁接苗进行光培养促嫁接口愈合和幼苗生长；炼苗移栽步骤：将嫁接苗在光培养15天后，当砧木根部开始生长，且接穗叶片呈正常叶色并有新叶生长时将试管置于自然光中炼苗10-15天，再去除封口膜炼苗1天后，移栽于体积比为2:1的泥炭和珍珠岩混合物的栽培基质中，移栽后在封闭的塑料拱棚内保温保湿培养，一周后逐渐通风，直至去掉塑料拱棚。进一步地，在所述诱导培养步骤之前还包括外植体预处理步骤，所述淡水砂梨外植体由淡水砂梨新梢经外植体预处理步骤后形成，所述外植体预处理步骤为：将采集的长为5-10cm的淡水砂梨新梢冲洗干净表面杂物后置于饱和的洗衣粉溶液中浸泡5-10分钟，换净水漂洗3-5次后置于流动自来水中冲洗5-12小时，最后用封口袋密封装好置于4-10℃冰箱中备用。进一步地，在诱导培养步骤中，所述带芽茎段为带包含顶芽或侧芽的单个芽的茎段、带包含顶芽和侧芽或均为侧芽的两个芽的茎段或者带包含顶芽和侧芽的三个芽的茎段。进一步地，砧木培养步骤中的后熟处理为：棠梨果实成熟时采集无病虫害、发育良好的果实放于室外堆放沤烂，堆放的高度20-30cm，使果实堆积中心处不发热损伤种子，等果实软熟后，捣烂果实，水洗去掉腐烂的果肉和浮水的不饱满种子，将干净种子置阴凉通风荫干后装入塑料封口袋放入2-4℃冰箱保存30天后备用。进一步地，所述暗培养为培养温度在23-27℃的条件下无光照的培养；所述光培养为培养温度在23-27℃的条件下每天光照12-16小时，光照强度1500-2100lx的培养。进一步地，灭菌的步骤为在1.1-1.5kgf/cm2和121℃的高压高温条件下在蒸汽锅内消毒18-20分钟。进一步地，诱导培养步骤中所述的诱导培养基为：以MS为基本培养基，附加0.5-1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤/6-BA、0.08-0.15mg/L吲哚乙酸/IBA、附加2.5-3.0％蔗糖和0.4-0.7％琼脂，pH值为5.60-5.80；继代增殖步骤中所述的增殖培养基为：以MS为基本培养基，附加2.0-4.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤/6-BA、0.04-0.08mg/L吲哚乙酸/IBA，附加2.5-3.0％蔗糖和0.4-0.7％琼脂，pH值为5.60-5.80；砧木培养步骤中所述的种子萌发培养基为：以MS为基本培养基，附加0.1-0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤/6-BA、0.08-0.15mg/L吲哚乙酸/IBA，附加2.5-3.0％蔗糖和0.4-0.7％琼脂，pH值为5.60-5.80；试管内微嫁接步骤中所述的液体培养基为：以1/2MS为基本培养基另加0.3-0.7mg/L吲哚乙酸/IBA和2.0-2.5％蔗糖，pH值为5.60-5.80。1/2MS为MS培养基配方中大量元素减半，其他元素不变而配制的培养基。更进一步地，所述的MS培养基配方由如下各化合物组成，分为大量元素、微量元素、铁盐和有机物四类物质：大量元素含硝酸钾/KNO31900mg/L，硝酸铵/NH4NO31650mg/L，氯化钙/CaCl2·2H2O440mg/L，硫酸镁/MgSO4·7H2O370mg/L，磷酸二氢钾/KH2PO4170mg/L；微量元素含碘化钾/KI0.83mg/L，硼酸/H3BO36.2mg/L，硫酸锰/MnSO4·4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于，包括：诱导培养步骤：将淡水砂梨外植体置于0.1％‑0.3％的升汞溶液消毒10‑16分钟，然后用无菌水冲洗5‑6次，经无菌滤纸吸干水分后，用接种刀切成带1‑3个顶芽和/或侧芽的长为0.5‑2cm的带芽茎段，将所述带芽茎段为外植体接种到已灭菌并凝固的诱导培养基上，将接种后的诱导培养基先暗培养5‑10天，再在光培养条件下诱导外植体茎段的顶芽或侧芽萌发，形成无菌试管苗；继代增殖步骤：在无菌条件下将诱导培养的高为2‑4cm的无菌试管苗用接种刀切下转接到已灭菌并凝固的增殖培养基上进行增殖，并进行光培养30‑40天，促无菌试管苗的侧芽或不定芽萌发获得丛生的无根组培苗，将无根组培苗在无菌条件下用接种刀切分为单株组培苗，选取高于1.5cm的单株组培苗转接到增殖培养基上，多次继代培养获得无根组培苗，经继代培养30‑40天后的无根组培苗作为微嫁接的接穗；砧木培养步骤：将后熟处理过的棠梨种子用缓慢流水冲洗30‑60分钟，晾干后用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3次后沥干，用0.1％‑0.3％升汞溶液消毒4‑8分钟，消毒结束用无菌水漂洗5‑6次，然后接种到已灭菌并凝固的种子萌发培养基上，将接种后的种子萌发培养基先暗培养5‑10天，然后在光培养条件下诱导种子萌发，形成无菌的棠梨幼苗，棠梨幼苗生长到第二片真叶形成时作为微嫁接的砧木；试管内微嫁接步骤：将锡纸裁成0.5cm×1.5cm的条形，经高压灭菌后备用；在无菌条件下，取出砧木将其截顶，留3‑4cm长的茎，将底部侧芽和叶片用镊子摘除，沿砧木茎段顶部纵切形成长度为0.4‑0.6cm的切口；选取高度为2‑5cm、粗度与砧木茎段相近的接穗，在接穗的顶部留2‑6片叶子，并将其基部削成长度为0.4‑0.6cm的楔形结构，将接穗的楔形基部插入砧木苗茎段的切口中，使切口密贴，砧木和接穗至少有一边的边缘对齐，用锡纸将嫁接口绑缚，获得微嫁接苗；并将微嫁接苗放入已灭菌并冷却至室温的盛有液体培养基的试管中，液体培养基占试管体积的1/4，液体培养基表面放入锡纸以固定嫁接苗使液体不没过嫁接苗的根茎部位，用无菌封口膜封住试管口，将微嫁接苗进行光培养促嫁接口愈合和幼苗生长；炼苗移栽步骤：将嫁接苗光培养15天后，当砧木根部开始生长，且接穗叶片呈正常叶色并有新叶生长时将试管置于自然光中炼苗10‑15天，再去除封口膜炼苗1天后，移栽于体积比为2:1的泥炭和珍珠岩混合物的栽培基质中，移栽后在封闭的塑料拱棚内保温保湿培养，一周后逐渐通风，直至去掉塑料拱棚。...

【技术特征摘要】
1.一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于，包括：诱导培养步骤：将淡水砂梨外植体置于0.1％-0.3％的升汞溶液消毒10-16分钟，然后用无菌水冲洗5-6次，经无菌滤纸吸干水分后，用接种刀切成带1-3个顶芽和/或侧芽的长为0.5-2cm的带芽茎段，将所述带芽茎段为外植体接种到已灭菌并凝固的诱导培养基上，将接种后的诱导培养基先暗培养5-10天，再在光培养条件下诱导外植体茎段的顶芽或侧芽萌发，形成无菌试管苗；继代增殖步骤：在无菌条件下将诱导培养的高为2-4cm的无菌试管苗用接种刀切下转接到已灭菌并凝固的增殖培养基上进行增殖，并进行光培养30-40天，促无菌试管苗的侧芽或不定芽萌发获得丛生的无根组培苗，将无根组培苗在无菌条件下用接种刀切分为单株组培苗，选取高于1.5cm的单株组培苗转接到增殖培养基上，多次继代培养获得无根组培苗，经继代培养30-40天后的无根组培苗作为微嫁接的接穗；砧木培养步骤：将后熟处理过的棠梨种子用缓慢流水冲洗30-60分钟，晾干后用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3次后沥干，用0.1％-0.3％升汞溶液消毒4-8分钟，消毒结束用无菌水漂洗5-6次，然后接种到已灭菌并凝固的种子萌发培养基上，将接种后的种子萌发培养基先暗培养5-10天，然后在光培养条件下诱导种子萌发，形成无菌的棠梨幼苗，棠梨幼苗生长到第二片真叶形成时作为微嫁接的砧木；试管内微嫁接步骤：将锡纸裁成0.5cm×1.5cm的条形，经高压灭菌后备用；在无菌条件下，取出砧木将其截顶，留3-4cm长的茎，将底部侧芽和叶片用镊子摘除，沿砧木茎段顶部纵切形成长度为0.4-0.6cm的切口；选取高度为2-5cm、粗度与砧木茎段相近的接穗，在接穗的顶部留2-6片叶子，并将其基部削成长度为0.4-0.6cm的楔形结构，将接穗的楔形基部插入砧木苗茎段的切口中，使切口密贴，砧木和接穗至少有一边的边缘对齐，用锡纸将嫁接口绑缚，获得微嫁接苗；并将微嫁接苗放入已灭菌并冷却至室温的盛有液体培养基的试管中，液体培养基占试管体积的1/4，液体培养基表面放入锡纸以固定嫁接苗使液体不没过嫁接苗的根茎部位，用无菌封口膜封住试管口，将微嫁接苗进行光培养促嫁接口愈合和幼苗生长；炼苗移栽步骤：将嫁接苗光培养15天后，当砧木根部开始生长，且接穗叶片呈正常叶色并有新叶生长时将试管置于自然光中炼苗10-15天，再去除封口膜炼苗1天后，移栽于体积比为2:1的泥炭和珍珠岩混合物的栽培基质中，移栽后在封闭的塑料拱棚内保温保湿培养，一周后逐渐通风，直至去掉塑料拱棚。2.根据权利要求1所述的淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于：在所述诱导培养步骤之前还包括外植体预处理步骤，所述淡水砂梨外植体由淡水砂梨新梢经外植体预处理步骤后形成，所述外植体预处理步骤为：将采集的长为5-10cm的淡水砂梨新梢冲洗干净表面杂物后置于饱和的洗衣粉溶液中浸泡5-10分钟，换净水漂洗3-5次后置于流动自来水中冲洗5-12小时，最后用封口袋密封装好置于4-10℃冰箱中备用。3.根据权利要求1所述的淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于：在诱导培养步骤中，所述带芽茎段为带包含顶芽或侧芽的单个芽的茎段、带包含顶芽和侧芽或均为侧芽的两个芽的茎段或者带包含顶...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾令达，彭长连，宋冠华，尹艳，郑倩，翟秋艳，
申请(专利权)人：惠州学院，
类型：发明
国别省市：广东,44