用于检测乳酸菌BCAT酶活的复合电极及其制备方法与应用、检测NADH方法技术

本发明专利技术属于电化学检测领域，公开了一种用于检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的复合电极，在玻碳电极表面上修饰一层MWCNT/PDDA复合膜而制得的MWCNT/PDDA‑GCE复合电极。本发明专利技术又公开了上述复合电极的制备方法。本发明专利技术还公开了用于BCAT酶活电化学检测的复合电极在检测BCAT酶活上的应用。本发明专利技术又公开了一种检测NADH的电化学方法。本发明专利技术的电化学传感器简便易行、易微型化、智能化、易于集成、操作简易等优点，最重要的是灵敏度高和选择性好，真正实现了对BCAT酶活快捷、简便以及高效的检测。

Composite electrode for detecting Lactobacillus BCAT enzyme activity, its preparation method and application, and NADH detection method

The invention belongs to the field of electrochemical detection, and discloses a composite electrode of an electrochemical sensor for detecting BCAT activity of lactic acid bacteria, which is prepared by modifying a layer of MWCNT/PDDA composite film on the surface of a glassy carbon electrode. The invention also discloses a preparation method of the composite electrode. The invention also discloses the application of a composite electrode for the electrochemical detection of BCAT enzyme activity in the detection of BCAT enzyme activity. The invention also discloses an electrochemical method for detecting NADH. The electrochemical sensor of the invention has the advantages of simplicity, miniaturization, intelligence, easy integration, simple operation, etc. The most important thing is high sensitivity and good selectivity, which truly realizes fast, simple and efficient detection of BCAT enzyme activity.

【技术实现步骤摘要】
用于检测乳酸菌BCAT酶活的复合电极及其制备方法与应用、检测NADH方法
本专利技术属于电化学检测领域，涉及一种新型检测乳酸菌支链氨基酸转氨酶(BCAT)酶活的方法，具体涉及一种检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的构建。
技术介绍
支链氨基酸(Branched-chainaminoacids，BCAAs)是指含有短脂肪族侧链的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。这三种氨基酸最先发现和研究最为广泛的是亮氨酸，但是三种支链氨基酸的代谢机理相似。支链氨基酸转氨酶(Branched-chainaminotransferase，BCAT)广泛存在于部分细菌、酵母、植物、哺乳动物和人体内且不同菌种体内BCAT活力会有很大不同。支链氨基酸在微生物的作用下可进行分解代谢，例如乳酸菌及葡萄球菌等。Stahnke通过研究发现，亮氨酸通过分解代谢可以产生3-甲基丁醛、3-甲基丁醇和3-甲基丁酸；。Beck通过对木糖葡萄球菌降解亮氨酸的研究发现这种降解还能够促进木糖葡萄球菌合成细胞膜所需的支链脂肪酸。Afzal等研究表明，乳酸菌中亮氨酸的代谢只存在转氨反应这一条路径，在此条件基础上，通过图2乳酸菌中亮氨酸代谢机理可以判断出：在亮氨酸的代谢过程中，转氨反应伴随着还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的产生。在转氨反应的过程中，生成α-酮异己酸生成α-羟基异己酸以及异戊酰辅酶A，3-甲基丁醛生成3-甲基丁醇以及3-甲基丁酸的过程中都能够产生NADH，将亮氨酸的后续反应看做一个整体反应，则可以通过检测NADH的含量来代表转氨酶的活性，由此可以得出电化学检测NADH能够代表乳酸菌中支链氨基酸转氨酶酶活，从而达到检测转氨酶活力的目的。现如今转氨酶检测方法的主流还是由国际临床化学和试验室医学联盟推荐的光学方法，其原理是通过包括吸光度值、光谱检测、色谱测量等检测酶促反应的终产物，终产物的含量与酶活呈正相关，酶活越高酶促反应所产生的终产物就越多，以此来建立光学检测与酶活检测的联系。除检测吸光度值来测定转氨酶活性外，国内外还有光谱测量、化学发光以及色谱分析等方法，但是由于光学方法已经有了长足的发展，在技术层面上也比其他方法更加成熟，所以其应用也更加广泛，但光学方法也有所需试剂多、成本昂贵、检测精度低等缺点。新兴的电化学方法检测转氨酶技术目前有一定的研究，电化学检测转氨酶的原理是检测转氨酶反应中所产生的具有电活性的物质，通过捕捉电极表面上电化学活性物质氧化还原反应产生的电信号联系转氨酶反应与酶活性。现如今电化学检测转氨酶的方法主要是检测产生的电活性物质H2O2，也有学者通过电化学微分脉冲法检测NAD+来反应酶活，但是由于H2O2物不稳定，NAD+来的电化学响应不灵敏，而NADH作为一种稳定的电活性物质在电化学领域有着广泛的应用，其作用原理为NADH在电极表面被氧化生成NAD+同时释放电子产生电流，产生的电流则通过电化学传感器被检测。NADH的电化学检测方法现如今已经多种多样，由于NADH在裸电极基体上的不可逆氧化，其在相当大的电位下会伴随着电极表面的钝化。因此，研制一种灵敏度高，选择性好，操作简易的检测方法是本专利技术的目的所在。该领域的研究主要集中在通过改进的电化学传感器表面降低NADH的氧化过电位和增加电转移率。电化学介质可有效降低检测NADH的氧化电压，选择适当的介质以及开发这些化合物的固定化方法在文献中有广泛的描述。最近，许多纳米材料，特别是碳纳米材料已被成功地用于在没有氧化还原介质的帮助下，改善NADH和电极之间的电转移。在众多的碳纳米材料修饰材料中碳纳米管(Multi-wallednanotubes，MWCNT)作为一种新型的纳米材料能够有效规避NADH氧化过电位。扬州大学杜楠使用碳纳米管-壳聚糖复合物构建电化学传感器检测乳酸菌支链氨基酸转氨酶酶活，她使用构建的电化学体系检测不同浓度亮氨酸对应的BCAT酶活，并未检测其余两种BCAA对应的BCAT酶活。该复合物对NADH检测的线性范围为1.0μm-9.0μm，检测限为0.2μm，检测便捷但检测限较高以及在水溶液和空气中的稳定性较差，并且常规氧化还原介体和电活性聚合物的相容性也是一个问题。聚电解质是从附着在分子极性基团的单体上获得的聚合物。聚合物链含有相同符号的带电基团。取决于带电基团的pKa，聚电解质可以是强的(恒定电荷)或弱的(具有pH依赖性电荷)。它们适用于在水性介质中产生具有正电荷或负电荷的薄膜，逐层(LBL)材料，在传感中具有潜在的应用。正电荷聚电解质如聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDDA)，聚(烯丙胺盐酸盐)(PAH)或带负电的聚苯乙烯磺酸盐(PSS)，聚丙烯酸(PAA)是常用于传感器和生物传感器的开发。导电聚合物已被用作固定酶的潜在材料，因为它们具有许多引人注目的特征，例如(1)将电子直接转移到酶和从酶转移的能力，同时作为捕获酶的合适基质；(2)导电聚合物具有柔性化学结构；(3)这些材料与酶活性必需的中性溶液相容；(4)在水溶液和空气中具有良好的稳定性；(5)如果干扰物质具有与分析物相反的电荷，则消除可能到达电极表面的干扰。聚电解质层确保了高活性区域，分析物和聚合物之间的静电相互作用可以促进电极表面的积累，从而增强分析信号和增加电转移率。PDDA本身或与其他聚电解质结合可发挥双重作用，其中改善NADH的检测，其次可以作为脱氢酶的良好固定化基质。
技术实现思路
本专利技术针对已有的光学检测方法的局限性，通过电化学传感器方式，构建利用传统“三电极”结构实现对BCAT酶活快捷、简易、高效的检测。本专利技术公开了一种电化学检测支链氨基酸转氨酶(BranchedChainAcidTransaminase，BCAT)酶活的方法。由于乳酸菌中氨基酸在转氨反应过程中伴随着还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的产生，因此将电化学检测NADH与乳酸菌中转氨反应相结合建立更加灵敏的乳酸菌BCAT检测体系。以乳酸菌中BCAT酶促反应产物NADH为研究对象，用聚二烯丙基二甲基氯化铵(poly(diallyldimethylammoniumchloride)，PDDA)分散生物兼容性好的多壁碳纳米管(Multi-wallednanotubes，MWCNT)来制备MWCNT/PDDA复合物，将此复合物采用一步滴涂法修饰在玻碳电极上。依据不同浓度的NADH在传感器界面上的电流变化来定量表达乳酸菌中BCAT酶活。本专利技术的电化学传感器简便易行、易微型化、智能化、易于集成、操作简易等优点，最重要的是灵敏度高和选择性好，真正实现了对BCAT酶活快捷、简便以及高效的检测。本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测BCAT酶活的电化学传感器的复合电极，其特征在于，所述复合电极是在玻碳电极表面上修饰一层MWCNT/PDDA复合膜而制得的MWCNT/PDDA-GCE复合电极；MWCNT/PDDA复合膜是将多壁碳纳米管溶液均匀分散到PDDA水溶液中制备得到。本专利技术的第二个目的是提供的用于BCAT酶活电化学检测的复合电极的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：(1)将多壁碳纳米管溶液均匀分散到PDDA水溶液中，得到MWCNT/PDDA复合溶液；1mg多壁碳纳米管对应4.5mgPDDA；(2)将复合溶液超声处理15-20分钟；(3)玻碳电极的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的复合电极，其特征在于，所述复合电极是在玻碳电极表面上修饰一层MWCNT/PDDA复合膜而制得的MWCNT/PDDA‑GCE复合电极；MWCNT/PDDA复合膜是将多壁碳纳米管溶液均匀分散到PDDA水溶液中制备得到。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的复合电极，其特征在于，所述复合电极是在玻碳电极表面上修饰一层MWCNT/PDDA复合膜而制得的MWCNT/PDDA-GCE复合电极；MWCNT/PDDA复合膜是将多壁碳纳米管溶液均匀分散到PDDA水溶液中制备得到。2.权利要求1所述的用于检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的复合电极的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：（1）将多壁碳纳米管溶液均匀分散到PDDA水溶液中，得到MWCNT/PDDA复合溶液；1mg多壁碳纳米管对应4.5mgPDDA；（2）将复合溶液超声处理15-20分钟；（3）玻碳电极的前处理方法：先将裸玻碳电极用金相砂纸打磨，然后依次用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光至镜面，用麂皮擦拭以除去残留在电极表面的Al2O3，再将电极分别在无水乙醇和超纯水中超声3min，最后用超纯水冲洗干净后在室温下晾干；（4）将超声处理后的复合溶液用移液枪吸取5µL至前处理过的玻碳电极表面，在红外烤灯下干燥至室温。3.权利要求1所述的用于检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的复合电极在检测BCAT酶活上的应用：电化学检测支链氨基酸转氨酶酶活的方法。4.权利要求3所述的用于检测乳酸菌BCAT酶活的电化学传感器的复合电极在检测BCAT酶活上的应用，其特征是，所述电化学检测支链氨基酸转氨酶酶活的方法为：（1）配置标准三电极体系：铂丝为对电极，甘汞电极为参比电极，MWCNT/PDDA-GCE复合电极为工作电极；（2）检测：将乳酸菌按体积浓度为1%的接种量接种于MRS液体培养基中37℃培养24h，进行第一次活化；之后再将第一次活化后的菌液接种于MRS液体培养基，37℃培养24h进行第二次活化，将第二次活化后的菌液离心取沉淀，然后重悬于无菌生理盐水中再次离心，重复操作两至三次，最后将离心后的菌体重悬于PBS中调节菌体浓度至OD600=0.20；取8mL菌液，加入2mL含有亮氨酸、α-酮戊二酸、PLP、N...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海，王彦清，杜楠，葛庆丰，吴满刚，刘瑞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32