一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种优化的牙鲆鱼β‑肌动蛋白启动子，本发明专利技术将在牙鲆中广泛表达的β‑肌动蛋白的启动子进行优化进而获得启动效率更强的重组启动子表达载体eGFP‑优β‑肌动蛋白。并且这一新的载体可使外源基因有效转入牙鲆不同细胞系，为鲆鲽鱼类基因功能的研究提供了一种新的途径和方法，为解决鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低提供一种有效的可行的载体，为在细胞水平研究分析基因功能提供高效的手段，为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的技术方法。

An optimized beta actin promoter from Paralichthys olivaceus

The object of the present invention is to provide an optimized beta-actin promoter for flounder. The promoter of beta-actin widely expressed in flounder is optimized to obtain a recombinant promoter expression vector eGFP-excellent beta-actin with higher startup efficiency. This new vector can effectively transfer exogenous genes into different cell lines of flounder, which provides a new way and method for the study of gene function of flounder fish, provides an effective and feasible vector for solving the low efficiency of transient transfection of flounder fish cells, and provides a high efficiency for the study and analysis of gene function at the cellular level. This method provides a new technique for genetic breeding of flounder fish.

【技术实现步骤摘要】
一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子
本专利技术属于蛋白转录翻译
，具体涉及一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子。
技术介绍
β-肌动蛋白是真核细胞中最丰富的蛋白质，在进化过程中非常保守，并且β-肌动蛋白参与关键的生物过程，如转录、mRNA加工和染色质重塑等。它在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测目标基因转录水平以及蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。另外它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。基因表达体系是一个复杂的过程，目前在海水鱼类中还不是很成熟，这已成为在细胞水平上分析和个体水平上研究海水鱼类基因功能的主要瓶颈之一。近年来，科研工作者在海水鱼表达载体构建方面取得了一些进展，但是表达系统的效率还是不足以有效研究水鱼类基因功能。而在载体系统的改造过程中，启动子调控元件起着重中之重的作用，选用强启动子可以使克隆基因高水平表达。因此，从启动子出发，设计强启动子元件，构建成熟高效的表达系统，无论是在理论研究还是实际生产中都有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子，能够更高效的使外源基因在牙鲆细胞系中进行表达，从而弥补现有技术的不足。本专利技术所提供的优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子，其核苷酸序列为SEQIDNO:2的；本专利技术所提供的优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子，是将核苷酸序列为SEQIDNO:1的牙鲆启动子进行序列分析，把原序列每隔200bp～300bp长的片段进行删除，进而获取不同的启动子突变体；在进行筛选获得的。本专利技术所提供的优化后的启动子用于制备重组表达载体；本专利技术再一个方面提供一种将外源基因转染入牙鲆细胞的方法，是使用上述的重组表达载体将外源基因转染入牙鲆细胞。所述的方法，是待牙鲆细胞汇合度达70％—80％时，把脂质体和外源DNA质粒复合物加入到细胞培养基中对牙鲆细胞进行转染；培养48h后进行绿色荧光检测，鉴定优化后的启动子启动效率。本专利技术方法可将在牙鲆中广泛表达的β‐肌动蛋白的启动子进行优化进而获得启动效率更强的重组启动子表达载体eGFP-优β-肌动蛋白。并且这一新的载体可使外源基因有效转入牙鲆不同细胞系，为鲆鲽鱼类基因功能的研究提供了一种新的途径和方法，为解决鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低提供一种有效的可行的载体，为在细胞水平研究分析基因功能提供高效的手段，为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的技术方法。附图说明图1：不同突变型牙鲆β‐肌动蛋白启动子双荧光报告载体图；图2：不同突变型β‐肌动蛋白启动子在牙鲆胚胎细胞双荧光报告结果图；图3：不同突变型β‐肌动蛋白启动子在牙鲆脑细胞双荧光报告结果图；图4：eGFP-优β-肌动蛋白和eGFP-β-肌动蛋白的表达效率比较图；图5：eGFP-优β-肌动蛋白质粒在活体上启动效率图。具体实施方式本专利技术采用的是对β-肌动蛋白启动子自身的不同区域进行长片段缺失分析，进而分别高效的识别出启动子上不同片段对启动子启动活性的贡献，即有效识别启动子上的沉默区域和活性区，进而构建出高活性的启动子。本专利技术通过对启动子的改造，大大提高了启动子活力，实现了外源蛋白的高效表达，这对于研究海水鱼类基因功能分析等至关重要。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1启动子的优化申请人对之前发现的核苷酸序列为SEQIDNO:1的优化牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子过程，具体方法如下：1、对全长1614bp序列的牙鲆启动子进行序列分析，把原序列每隔200bp～300bp长的片段进行删除，进而获取不同的启动子突变体序列。1)以双荧光报告载体pGL-3basic为基础，插入牙鲆鱼的β-肌动蛋白启动子全长序列构建成双荧光报告载体质粒，在牙鲆β-肌动蛋白启动子基因上设计一对两端带有限制性内切酶位点的PCR引物，其中5’和3’引物上加分别入了KpnⅠ和HindⅢ的酶切位点，进行PCR。其引物如下：5’-primer:5’-CGGGGTACCCGCGTCGTGCCCCAGTGT3’-primer:5’-CCCAAGCTTGGCTGAACTGCAGAGAGGAGAGAPCR反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性30sec，67℃退火30sec，72℃延伸2.5min，进行31个循环，接着72℃后延伸10min。2)利用胶回收试剂盒(TM16090646)回收扩增的牙鲆β-肌动蛋白启动子片段，连接在pMD19-T载体上，利用氨苄抗性筛选带有目的片段的阳性菌。3)利用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ分别切开带有牙鲆β-肌动蛋白启动子基因的质粒和pGL-3basic质粒，并使用胶回收试剂盒(TM16090646)回收切开的质粒片段；4)使用T4连接酶将牙鲆β-肌动蛋白启动子全长基因片段和pGL-3basic质粒片段链接起来，构建包含牙鲆β-肌动蛋白启动子全长片段的双荧光报告载体pGL3-β-肌动蛋白(图1)。5)以pGL3-β-肌动蛋白为基础，分别设计进行获取不同突变体的引物，进行PCR。其引物如下：Del-1～-200-Fw5’-ggtaataacagagcgcaagcttggcattccggDel-1～-200-Rv5’-ccggaatgccaagcttgcgctctgttattaccDel-201～-500-Fw5’-gcaactacgtcttttttttttgtgttaacgtagcgccacttccttttDel-201～-500-Rv5’-aaaaggaagtggcgctacgttaacacaaaaaaaaaagacgtagttgcDel-501～-800-Fw5’-caagattaaaaatgaaatccctcattaaaaacgcgacgttgtgcggDel-501～-800-Rv5’-ccgcacaacgtcgcgtttttaatgagggatttcatttttaatcttgDel-801～-1080-Fw5’-aggaagccggctccggattcttacgtgcacDel-801～-1080-Rv5’-gtgcacgtaagaatccggagccggcttcctDel-1081～-1399-Fw5’-cccccacccaaaaaagaggttcttgtgcgctgDel-1081～-1399-Rv5’-cagcgcacaagaacctcttttttgggtgggggDel-1400～-1614-Fw5’-tctatcgataggtaccgtaagaggaccaccgcDel-1400～-1614-Rv5’-gcggtggtcctcttacggtacctatcgatagaDel-1400～-1489-Fw5’-taacggattcactctggtaagaggaccaccgcDel-1400～-1489-Rv5’-gcggtggtcctcttaccagagtgaatccgttaPCR反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸7min，进行30个循环，接着72℃后延伸10min。之后用DpnⅠ消化30min，除去体系中的pGL3-β-肌动蛋白载体，进而分别获取pGL-Poβ-肌动蛋白Δ1，pGL-Poβ-肌动蛋白Δ2，pGL-Poβ-肌动蛋白Δ3，pGL-Poβ-肌动蛋白Δ4，pGL-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种优化的牙鲆鱼β‑肌动蛋白启动子，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列为SEQIDNO:2。2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述的启动子是将核苷酸序列为SEQIDNO:1的牙鲆启动子进行序列分析，把原序列每隔200bp～300bp长的片段进行删除，进而获取不同的启动子突变体；在进行筛选获得的。3.权利要求1所述的启动子在制备重组表达载体中的应用。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐洁，汪波，王慧贞，张全启，贺艳，王志刚，于海洋，王旭波，程杰，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37