利用碱基编辑修复FBN1制造技术

本发明专利技术提供了一种利用碱基编辑修复FBN1

Using base editing to repair FBN1

The invention provides a base for editing and repairing FBN1.

【技术实现步骤摘要】
利用碱基编辑修复FBN1T7498C突变的试剂和方法
本专利技术涉及基因修复领域，更具体来说，利用碱基编辑修复马凡氏综合征相关的FBN1T7498C突变的方法。
技术介绍
目前为止医学上已经鉴定出了接近一万种遗传病，对家庭和社会造成了巨大的负担，然而只有大约6％的遗传病目前可以治疗(AustinandDawkins，2017)。诊断和治疗遗传病已经是医学上的重要研究内容。高通量测序技术的发展已经使得遗传病的诊断变得较为容易。虽然附植前遗传学诊断(PGD)可以阻断部分遗传病的发生，然而对一些诸如纯合突变等遗传病，尚需要开发更有效的遗传学治疗手段(Dunbaretal.，2018)。基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9，已经广泛应用于基因操作，并且可以应用于精准修复致病突变(Komoretal.，2017)。同时目前该技术在人胚胎上的基因编辑也展示出了巨大的优势，提示其在人遗传病治疗中的临床价值(Kangetal.，2016)。然而限于伦理和治疗的效率及脱靶的存在，基因编辑在人胚胎中的应用还有巨大的提升空间(RuzoandBrivanlou，2017)。CRISPR/Cas9介导的基因编辑是在sgRNA(singleguidedRNA)通过靶序列互补引导Cas9蛋白定位剪切双链DNA，造成双链DNA断裂(double-strandbreaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)修复，造成移码突变(ffameshiftmutation)，导致基因敲除(knockout)；在有模板的条件下，通过同源重组进行修复(homology-directedrepair，HDR)，实现基因敲入(knockin)，由于HDR效率低(整合很少发生)，而且非同源性末端接合机制容易产生随机插入和删除(indel)，使得在断裂点附近可能随机引入新的碱基，从而导致不精确的基因编辑(Hsuetal.，2014)。此外，CRISPR/Cas9介导的基因编辑总有一些脱靶效应[Gorskietal.，2017]。最近开发出来的碱基编辑系统，baseeditor，是在切口酶nCas9的基础上加上了大鼠的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1，碱基编辑系统可以在不切割DNA双链的情况下，实现靶位点上C转化为尿嘧啶(Komoretal.，2016)。之后，通过DNA复制或修复，尿嘧啶被转化成胸腺嘧啶(T)，进而实现C到T的转换，类似地，其也能将单碱基G转化成A。由于不切割DNA造成DSB，形成的indel低于1％，实现的基因编辑更精确。碱基编辑系统已经被成功应用于体内碱基编辑，实现了小鼠的CT突变。我们利用BE3在人的废弃胚胎中也实现了靶位点的高效编辑。马凡氏综合征是一种常染色体显性遗传病，占世界人口的0.2‰，其主要造成人结缔组织的发育异常，目前已有多名知名运动员的猝死和马凡氏综合征有关(Arbustinietal.，2005)。虽然部分患者可以通过手术治疗，但对于后代仍然具有患病的风险，从遗传上治疗引起该病的突变将是根本的方法。前期已有表明FBN1基因的突变是造成马凡氏综合征的主因。因此能否找到高效同时安全性的治疗方法是我们追求的方向。本专利技术就是寻找一种更加高效和安全的修复马凡氏综合征相关的突变，达到在人胚胎阶段修复该突变的方法，降低此病的发病比例和巨大的社会负担。参考文献Arbustini，E.，Grasso，M.，Ansaldi，S.，Malattia，C.，Pilotto，A.，Porcu，E.，Disabella，E.，Marziliano，N.，Pisani，A.，Lanzarini，L.，etal.(2005).Identificationofsixty-twonovelandtwelveknownFBN1mutationsineighty-oneunrelatedprobandswithMarfansyndromeandotherfibrillinopathies.Humanmutation26，494.Austin，C.P.，andDawkins，H.J.S.(2017).Medicalresearch：Nextdecade′sgoalsforrarediseases.Nature548，158.Dunbar，C.E.，High，K.A.，Joung，J.K.，Kohn，D.B.，Ozawa，K.，andSadelain，M.(2018).Genetherapycomesofage.Science359.Hsu，P.D.，Lander，E.S.，andZhang，F.(2014).DevelopmentandapplicationsofCRISPR-Cas9forgenomeengineering.Cell157.1262-1278.Kang，X.，He，W.，Huang，Y.，Yu，Q.，Chen，Y.，Gao，X.，Sun，X.，andFan，Y.(2016).Introducingprecisegeneticmodificationsintohuman3PNembryosbyCRISPR/Cas-mediatedgenomeediting.Journalofassistedreproductionandgenetics33，581-588.Komor，A.C.，Badran，A.H.，andLiu，D.R.(2017).CRISPR-BasedTechnologiesfortheManipulationofEukaryoticGenomes.Cell168，20-36.Komor，A.C.，Kim，Y.B.，Packer，M.S.，Zuris，J.A.，andLiu，D.R.(2016).ProgrammableeditingofatargetbaseingenomicDNAwithoutdouble-strandedDNAcleavage.Nature533，420-424.Ruzo，A.，andBrivanlou，A.H.(2017).AtLast：GeneEditinginHumanEmbryostoUnderstandHumanDevelopment.CellStemCell21，564-565.
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒和方法。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统(baseeditor)以及针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA。优选地，所述的碱基编辑系统为BE3，YE1-BE3，YE2-BE3或者YEE-BE3中的一种。优选地，所述的针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA的序列为SEQIDNO.3。本专利技术还提供了一种制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据FBN1T7498C位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN、针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA以及碱基编辑系统中的至少一种。本专利技术还提供了一种碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，包括：在含有FBN1T7498本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统以及针对FBN1T7498C位点的修复re‑sgRNA。

【技术特征摘要】
1.一种高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统以及针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA。2.如权利要求1所述的高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，所述的碱基编辑系统为BE3，YE1-BE3，YE2-BE3或者YEE-BE3中的一种。3.如权利要求1所述的高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，所述的针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA的序列为SEQIDNO.3。4.一种制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据FBN1T7498C位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN、针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA以及碱基编辑系统中的至少一种。5.一种碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，包括：在含有FBN1T7498C的突变细胞中，利用针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA引导碱基编辑系统到突变位点进行碱基编辑修复，收集转染后的细胞。6.如权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄行许，李广磊，李佳楠，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31