本发明专利技术提供了磷转运蛋白基因GmPT5启动子的应用，具体公开的是GmPT5启动子在驱动豆科作物基因在根瘤中的表达及响应低磷方面的应用。通过启动子区段分析，克隆了GmPT5的不同长度的启动子，并证明了GmPT5的7个不同长度的启动子区段（包含5’UTR）均能驱动GUS蛋白在根瘤中的表达，不包含5’UTR的启动子区段则不能驱动GUS蛋白在根瘤中的表达，其中有1个区段驱动GUS蛋白在根瘤中的表达对低磷有响应。
Application of phosphate transporter gene GmPT5 promoter
The invention provides the application of phosphorus transporter gene GmPT5 promoter, in particular discloses the application of GmPT5 promoter in driving leguminous crop gene expression in nodules and responding to low phosphorus. The promoters of different lengths of GmPT 5 were cloned by promoter segment analysis. It was proved that all seven promoter segments of different lengths (including 5'UTR) of GmPT 5 could drive the expression of GUS protein in nodules. The promoter segments without 5'UTR could not drive the expression of GUS protein in nodules. One of them was driven by one promoter segment. The expression of GUS protein in nodules was responsive to low phosphorus.
【技术实现步骤摘要】
磷转运蛋白基因GmPT5启动子的应用
本专利技术涉及基因的新应用，具体涉及磷转运蛋白基因GmPT5启动子的应用，属于生物
技术介绍
磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一。无机磷通过细胞膜进入细胞是由同一或不同家族的多个磷转运蛋白基因负责，目前已知的磷转运蛋白基因按序列和功能相似性分为五大家族Pht1、Pht2、Pht3、Pho1和Pho2（杨存义等，2006）。由于Pht1家族基因主要负责根系对土壤磷的吸收，因此成为研究得最为深入的植物磷转运蛋白基因。Pht1磷转运蛋白家族基因的第一个成员是从酵母（Saccharomyceseerevisae）中分离得到（Bun-Yaetal,1991）。近年利用序列保守性分析，分别从拟南芥（Muchhaletal,1996）、马铃薯（Leggewieetal,1997）、烟草（Mitsukawaetal,1997）、苜蓿（Liuetal,1998）、大麦（Smithetal,1999）、白羽扇豆（Liuetal,2001）、水稻（Paszkowskietal,2002）、大豆（Qinetal,2012）等高等植物中克隆到很多个属于Pht1家族的磷转运蛋白基因。2012年，Qin等人已报道了大豆Pht1家族高亲和力的磷转运蛋白GmPT5在根瘤磷获取过程中的功能。GmPT5主要定位于大豆根部及根瘤的维管束系统，参与了磷从大豆根系向根瘤的转运；33P同位素原位吸收试验进一步证明了，超量或干涉该基因影响了磷从根部向根瘤的累积，表明GmPT5是调控低磷胁迫下根瘤磷动态平衡的关键基因，保证了低磷胁迫下根瘤对磷的较高需求（Qinetal.，2012）。目前，Pht1磷转运蛋白家族基因的研究主要集中于在转录水平上，基因的启动子和一些转录因子互作决定了基因表达的组织特异性和对环境变化的响应（Bermanetal.,2002;LeHiretal.,2003;Schallauetal.,2008）。启动子序列位于基因的上游，决定转录起始位点和频率。大部分启动子不仅含有TATA-box，还存在一些特异性的顺式作用元件，如低磷响应元件P1BS，根瘤相关元件NODCON1GM、NODCON2GM，菌根相关元件MYCS，PB1S（Darametal.,1998;Liuetal.,1998;Rubioetal.,2001;Schachtman&Shin,2007;Chenetal.,2011）。这些顺式元件被上游的转录调控因子结合，对于调控基因的表达具有重要的意义。研究启动子的调控分子机制有助于理解复杂的基因调控网络。目前，关于启动子的研究主要集中在其克隆及关键顺式作用元件的鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供磷转运蛋白基因GmPT5启动子的应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：磷转运蛋白基因GmPT5启动子在驱动豆科作物基因在根瘤中的表达及响应低磷方面的应用。所述的磷转运蛋白基因GmPT5启动子序列如SEQIDNO.1所示。所述磷转运蛋白基因GmPT5含有7个不同长度的启动子区段，各区段序列如SEQIDNO.2-8所示。专利技术人根据GmPT5的启动子序列设计8个不同的长度的启动子区段，通过融合GUS报告基因，利用转基因毛根接种根瘤菌观察GUS蛋白在根瘤中的表达情况，结果表明GmPT5的7个不同长度的启动子区段（包含5’UTR）均能驱动GUS蛋白在根瘤中的表达，不包含5’UTR的启动子区段则不能驱动GUS蛋白在根瘤中的表达，其中有1个区段驱动GUS蛋白在根瘤中的表达对低磷有响应。本专利技术的有益之处在于：此项研究对包括大豆在内的豆科作物驱动基因特异在根瘤中表达，尤其是对低磷响应的基因提供候选启动子资源。附图说明图1为8个启动子区段的模式图。图2为根瘤GUS染色图。图3为根瘤切片图。图4为GUS定量图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。实施例1、GmPT5启动子的克隆在已公布的大豆基因组数据库中下载GmPT5的启动子序列，使用TSSP-TCM在线软件（http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.phptopic=fgen）（Shahmuradov等2005）对测序结果进行分析,预测转录起始位点，使用NCBI在线软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）对测序结果进行分析，联合运用PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）（Higo等1998,1999）PlantCARE（http://bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）（Rom-bauts等1999;Lescot等2002）在线软件对其转录调控元件进行分析。将该启动子的不同区段与GUS基因合构建表达载体。取大豆品系HN89的叶子，采用CTAB法提取总DNA作为克隆GmPT5启动子片段的模板。根据大豆GmPT5基因（Glyma10g04230.1）5'侧翼序列设计引物，引物如下：在上下游引物的5'端分别加入NcoI和XbaI酶切位点和保护碱基。50μLPCR反应体系包括:1μL大豆基因组DNA、5μL10×LAPCR缓冲液、8μL（2.5mmol/L）dNTP、10μm/μL的上、下游引物各2μL、0.5μLLATaqDNA聚合酶（5U/μL）、31.5μLddH2O。PCR反应循环条件为94℃预变性2min;94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸3.1min,共进行30个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，然后切下3092bp的目的条带,使用凝胶回收试剂盒回收、纯化目的片段。将纯化产物与pMD18-T载体连接，再用DH10B感受态细胞进行转化,均匀涂布到含氨苄（100mg/L）的LB平板上，在37℃烘箱中培养12~13h，挑取单克隆菌落进行PCR检测，获得阳性克隆，命名为proPT5-T，阳性克隆委托北京奥科生物工程技术服务有限公司进行测序。以proPT5-T重组质粒为模板进行PCR扩增，分别得到3092(SEQIDNO.1)、2459(SEQIDNO.2)、1449(SEQIDNO.3)、1215(SEQIDNO.4)、1146(SEQIDNO.5)、401(SEQIDNO.6)、137(SEQIDNO.7)、1175(SEQIDNO.8)（不包括5’UTR和内含子的启动子片段）8个片段，将这8个片段替换植物表达载体pCAMBIA3301中的35S启动子，使每个片段分别与载体中的GUS报告基因融合,从而构建各启动子片段载体。pro3092::GUS、pro2459::GUS、pro1449::GUS、pro1215::GUS、pro1146::GUS、pro401::GUS、pro137::GUS和pro1175::GUS8个植物表达载体。图1为8个启动子区段的模式图。结果表明：以GmPT5翻译起始位点ATG前3092bp作为该基因的启动子序列，分析发现，该区段中包括GmPT5基因5’UTR端1325bp的序列。将GmPT5启动子片段（3092bp）通过TSSP-TCM（Shahmurado本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 磷转运蛋白基因GmPT5 启动子在驱动豆科作物基因在根瘤中的表达及响应低磷方面的应用。
【技术特征摘要】
1.磷转运蛋白基因GmPT5启动子在驱动豆科作物基因在根瘤中的表达及响应低磷方面的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的磷转运蛋白基因GmPT5启动子序...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖红，陈丽玉，李欣欣，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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